素材：基因工程教学中三个常见问题--高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

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1、基因工程教学中三个常见问题进化论的观点让我们认识到自然界中现存的生物物种和类群是由古代的生物经过几十亿年的长期进化而逐渐形成的，各物种之间存在着不同程度的亲缘关系。根据生物分类规则，自然界中的生物分为原核生物和真核生物。由于原核生物在基因结构、转录催化酶类、RNA 转录后加工、翻译过程及场所以及翻译后蛋白加工等方面都与真核生物存在显著差异，导致基因工程实际操作中目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因在受体细胞的表达及目的基因编码蛋白的活性等方面存在差异 1.原核生物细菌的基因直接导入真核生物的受体细胞，或真核生物基因( 如人的白细胞介素基因) 导入原核生物大肠

2、杆菌中能否表达获得重组蛋白的问题人教版高中生物学教材选择性必修 3 中，在基因工程部分开篇引用转基因抗虫棉案例，该案例是基于苏云金芽孢杆菌伴胞晶体蛋白( Bt 抗虫蛋白) 基因导入受体棉花细胞，再经组织培养而成的基因工程产品。我们知道，无论原核生物还是真核生物，一个完整的基因包括启动子、编码区和终止子等组成部分，但真核生物与原核生物基因的启动子、编码区及终止子都存在结构差异，直接利用其本身的启动子无法在跨类的受体细胞中表达。这是因为原核基因的启动子的基本结构是10 区的共同序列 TATA 盒( Pribnow box) 和35 区的共同序列 TTGACA( 图 1A) ，该结构则是与原核生物转

3、录催化酶 RNA 聚合酶的结构相适应的，原核生物典型的RNA 聚合酶的结构包含 2 个 亚基、1 个 亚基、1 个 亚基和 1 个 亚基，与启动子结合后还结合 1个 因子( 图 2A)。而真核生物基因典型的启动子包含了 25 30 区的 TATAAA 共 同序 列 ( Hognessbox) ，7080 区的共同序列 CCAAT( CAAT box) 以及80110 区的富含 GC 的保守序列( GC box) ( 图1B) ，真核生物启动子结构与真核生物 RNA 聚合酶相适应，真核生物的 RNA 聚合酶有3 类: RNA 聚合酶 I、RNA 聚合酶 II 以及 RNA 聚合酶 III。RNA

4、 聚合酶I 主要负责r RNA的转录，RNA 聚合酶 II 主要负责 m RNA的转录( 图 2B)，而 RNA 聚合酶III 主要催化 t RNA的合成。真核生物每类 RNA 聚合酶都由816 个亚基组成，结构与原核生物的 RNA 聚合酶有相似性，但都比原核生物 RNA 聚合酶复杂。因此，原核基因的表达需要受体细胞有原核生物的 RNA 聚合酶，真核基因表达需要受体细胞提供真核生物的 RNA 聚合酶。此外，真核生物的基因多数是断裂基因，即真核生物基因的编码区是由编码氨基酸的外显子和不编码氨基酸的内含子交替排列组成，转录产生的m RNA 前体( 核不均一 RNA) 需要进一步通过去除内含子、连接

5、外显子、5加上 m7Gppp Nm Nm“帽子”以及 3 添加 poly( A) “尾巴”，才能加工成为连续编码氨基酸序列的成熟 m RNA。原核生物中没有这套核不均一 RNA 的加工系统。因此，利用原核基因本身的启动子和编码序列转化真核生物受体细胞，或者利用真核生物基因的启动子和基因序列转化原核生物受体细胞，目的基因在受体细胞中无法表达。基因工程实际操作时，在原核生物中表达，要利用原核生物的启动子或噬菌体的启动子( 受体细胞提供噬菌体的 RNA聚合酶) ，在真核生物中表达目的基因时，应该利用真核生物或侵染真核生物病毒基因的启动子，当真核生物基因转化原核生物时，一般转化的是该基因的 c DNA

6、 而不是含有内含子的原始基因。2. 在进行基因表达载体的构建时，用于转化原核生物的表达载体上有RBS 序列，而转化真核生物的载体一般没有该序列 原核生物 m RNA 在起始密码子前712 个核苷酸处有一个保守序列，该序列与核糖体小亚基中 16S r RNA 的 3端反向互补，是核糖体结合在m RNA上引起翻译起始所必需的，该序列称为 SD 序列( Shine-Dagarno sequence) 或核糖体结合位点 (RBS，ribosome binding site) 。真核生物翻译的起始阶段，核糖体与m RNA的结合不依赖于m RNA1上存在的RBS，真核生物 40S核糖体上有一种m7Gppp

7、 Nm Nm“帽子”结合蛋白 (e IF 4E) ，该蛋白专一性识别m RNA“帽子”结构，使核糖体 40S 小亚基与m RNA 结合，经过真核生物翻译起始因子 e IF 3、e IF 4G和 poly( A) “尾巴”结合蛋白( PAB) 而结合在3poly( A) “尾巴”，最后通过大小亚基中 r RNA 的碱基配对，结合上60S 的大亚基，引起翻译的起始。在基因工程实际操作中，转化原核生物的表达载体上通常在启动子和目的基因之间插入了 RBS 编码序列，这样目的基因在原核生物的受体细胞中转录后形成的 m RNA 可以顺利与核糖体结合，实现目的基因控制重组蛋白合成的效果。3. 转基因的受体细

8、胞从DNA、RNA和蛋白质水平进行检测，结果都显示是阳性，但在个体水平上却检测不到目的基因编码蛋白质的活性 目的基因成功导入受体细胞后，基因会随着复制子的复制从亲代细胞传递给子代细胞，会通过转录产生 m RNA，也会通过翻译产生目的基因编码的蛋白质。但是让受体细胞产生目的基因控制性状，翻译出的蛋白质必须具有生物学活性。重组蛋白在受体细胞翻译出来以后，若其未能成功折叠、未能切除非功能肽段或未能进行蛋白质翻译后的修饰等，则 Western blotting 等方法能检测到重组蛋白的表达，却检测不到重组蛋白的活性。原核生物和真核生物都存在一些协助其他蛋白正确折叠成三级结构的分子伴侣，虽然部分蛋白质在

9、缺少分子伴侣的条件下，依靠热力学会自发折叠成有活性的三级结构，但也有一些蛋白质的折叠必须依赖特异的分子伴侣。此外，真核细胞中存在复杂的蛋白质后加工系统，如蛋白质 N 末端 Met 和非必需肽段的去除，分子内二硫键的形成和部分氨基酸残基的糖基化、磷酸化、甲基化等修饰加工，而原核生物中这些蛋白质翻译后加工能力比较有限。很多真核生物或人类基因( 如调节细胞增殖和免疫应答的细胞因子白细胞介素 6 的 c DNA) 转化大肠杆菌后可以大量表达重组白细胞介素6，但由于缺少合适的分子伴侣，该蛋白主要是以无规则蛋白颗粒包涵体的形式存在，在溶液中也不溶解，无法检测到其活性，需要在去垢剂存在下溶解包涵体，并经进一

10、步复性才能获得有活性的蛋白。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，重组猪胰蛋白酶原在酵母中实现表达后，需要体外肠激酶切除部分 C 末端肽段后才能具有蛋白酶活性。促红细胞生成素( 又称红细胞刺激因子或促红素) 是一种人体内源性糖蛋白激素，可刺激红细胞生成，糖基对于稳定蛋白的结构和功能非常重要。促红细胞生成素的 c DNA 导入大肠杆菌能够实现表达，但由于大肠杆菌无法对重组促红细胞生成素进行糖基化修饰，导致获得的重组蛋白生物学活性很低，若该 c DNA 在真核细胞( 如中国仓鼠卵巢细胞) 中表达，则获得的重组促红细胞生成素就显示明显的生物学活性。 科学思维和科学探究意识的培养基因工程教学伴随着大量科学思维训练的内容，体现在基于证据得出结论，严谨缜密的思维过程，合乎逻辑的推理判断。基因工程是人类通过技术手段实现了控制性状基因的跨越物种、跨越生物类群的流动，打破了物种的隔离障碍，为生物新品种培育和基因工程产品( 如重组蛋白类药物) 生产提供了一种便捷的途径。高中学生已经了解到了低等的原核生物和高等的真核生物之间的结构差异，具备了应用进化论分析和解决问题的基本能力。在基因工程实际教学过程中，涉及原核基因在真核受体细胞中表达或真核基因在原核受体细胞中表达，学生会基于对原核细胞和真核细胞的认识，提出若干转基因过程中影响目的基因表达的问题。学科网（北京）股份有限公司