基于喹啉、萘酰亚胺的双光子黏度荧光探针的设计、合成以及性能研究-宁鹏.docx

《基于喹啉、萘酰亚胺的双光子黏度荧光探针的设计、合成以及性能研究-宁鹏.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于喹啉、萘酰亚胺的双光子黏度荧光探针的设计、合成以及性能研究-宁鹏.docx（76页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 _ Y3214803 学校代码： 10357 密 级： 保密期限： 硕士学位论文 基于喹啉、萘酰亚胺的双光子黏度焚光探针的设 计、合成以及性能研究 - Design, Synthesis and Properties Study of Quinoline-based and Naphtha Iimide-based Two-photon Fluorescent Probes for Viscosity 学 号 G14201026 姓名 宁鹏 一级学科 化学 二级学科 有机化学 指导教师 _ : 孟 祥 明 教 授 完成时间 2017 年 5 月 万方数据 本人 F 明所呈交的学位论文是本人在

2、导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的斫究成果，也不包含为获得安徽大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作 _ 了明确的说明并表示谢意。 本学位论文作者完全了解安徵大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向囝家有关部门或机构这交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人缓权安徽大学珥以将学位论文的全部或部分内容 _入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复手段保存、汇编 学位论文。 f 保宠 1 _榮份备會在鏹脔荩括浮

3、1 太得敕书 ） 学位论文作者签名 : 学位论文版权使用授权书 万方数据 摘要 小分子荧光探针由于能够有效地定位细胞，快速地检测细胞中的诸如信号小 分子、金属离子、黏度、极性等生命微环境中重要的信号物质以及性能，已经成 为细胞显影方面的一种极其重要的工具。通过较为简单的合成方法，人 们就可以 设计并合成出理想的小分子荧光探针，对细胞甚至是亚细胞器中的生命微环境进 行荧光成像。近年来，双光子荧光探针相较于单光子荧光探针，已经成为一种检 测生命微环境中的极其重要的工具，基于其激发能量低，穿透深度大，光损伤小， 减少细胞自荧光干扰等一系列优点。 溶酶体作为细胞当中的 消化器官 ，其 pH 值偏酸性

4、(4.5 5.5)，其中含有大 量的搭解酶，承担了细胞生理过程中消化和溶解的作用。溶酶体的功能如果出现 紊乱，这将会对细胞的生理过程产生恶劣的影响，甚至会成为一系列疾病产生的 诱因。溶酶体黏度作为细胞中 一种重要的微环境性能，影响着细胞中的物质运输， 介质流动等生理过程。溶酶体黏度的异常变化可能会导致例如动脉硬化，阿兹海 默症，糖尿病等疾病。因而，设计一种检测细胞黏度、溶酶体黏度的双光子荧光 探针是有重大的研宄意义的。 本文在阅读和调研大量文献的基础上，设计并合成了两种双光子黏度荧光探 针，并通过质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱等表征手段对目标化合物进行了 精确的结构表征。而且，我们还通过对其

5、进行紫外可见光谱、荧光发射光谱和双 光子吸收截面的检测，进一步研宄了这两个双光子探针的光学性能。更重要的是， 我们还 对两种化合物进行了深入的生物荧光成像测试，包括共聚焦荧光生物成像、 荧光寿命成像、活体荧光成像等等，并取得了有意义的结果。 一、 简要介绍了荧光探针的构造以及荧光产生机理，双光子荧光显微成像技 术及其优点。 二、 设计并合成了一种基于喹啉基团为母体的双光子黏度荧光探针 MCN， 通过向甲氧基苯乙块六位取代的喹啉醛母体上引入一个强吸电子单元二氰基乙 烯基来合成探针 MCN。在这一结构中 ,利用二氰基乙烯基结构的强吸电子能力， 使其在这一分子结构中充当一个转子的角色，实现探针 MC

6、N 对以水和甘油为黏 度体系的溶液中和细胞微环境中的黏度响应。在 MCN 探针分子中，甲氧基结构 I liSSf 万方数据 单元作为供电子基，苯乙炔六位取代的喹啉结构单元作为大的共轭体系，二氰基 乙烯基结构单元作为吸电子基，共同构成了一个良好的 D-x-A 结构，这使得探 针 MCN 具有良好的双光子性能。同时，以喹啉基团作为探针母体，使得探针 MCN 具有水溶性好，生物毒性低，荧光信号强等优点。更重要的是，通过荧光 共聚焦显微成像以及荧光寿命成像并结合荧光寿命数值同黏度数值的线性关系 等实验证实， MCN 能够作为一个优秀的双光子黏度荧光探针检测 HeLa 细胞中 的黏度变化以及 HeLa

7、细胞中具体的黏度数值及其分布情况，同时还能对斑马鱼 活体中的黏度信号进行响应。 三、设计并合成了一种基于萘酰亚胺基团的双光子黏度荧光探针 LyS -NP, 作为溶酶体 |巴向双光子荧光探针用于检测溶酶体黏度变化。通过向萘二酰亚胺 , 氮原子上引入溶酶体定位基团吗啉结构，四位上引入二甲氨基苯乙炔单元结构， 合成得到探针LyS -NP。 在这一结构中，利用二甲氨基的强供电子能力，使其在 这一分子结构中充当转子的角色，从而实现探针 Lyso-NP 对以水和甘油为黏度 体系的溶液中以及亚细胞器瑢酶体中的黏度响应。在 Lyso-NP 探针分子中，二 甲氨基结构作为供电子基，苯乙炔四位取代的萘二酰亚胺结构

8、单元作为大的共轭 体系，二乙氨基吗啉结构作为吸电子基，共同构成了一个良好的 D-n-A 结构， 这使得探针 LyS -NP 具有良好的双光子性能。同时，以萘二酰亚胺基团作为探 针母体，使得探针 Lyso-NP 具有荧光信号稳定，生物低毒性的优势。在 MCF-7 细胞中进行生物共定位实验表明，探针 Lyso-NP能够很好地定位亚细胞器溶酶 体。更重要的是，通过荧光共聚焦显微成像以及荧光寿命成像并结合荧光寿命数 值同黏度数值的线性关系等实验证实， Lyso-NP 能够作为一个优秀的双光子黏度 荧光探针检测 MCF-7 细胞溶酶体中的黏度变化以及 MCF-7 细胞溶酶体中具体的 黏度数值及其分布情况

9、。 关键词：双光子；荧光探针；黏度；溶酶体；生物成像 万方数据 II Abstract Small molecular fluorescent probe has become the vital tool in cells imaging, due to its efficient localization in cells and quick detection of the micro-environmental signal substances and properties, such as signal small molecular, metal ions, viscosity

10、and polarity. People can design and synthesis ideal small molecular fluorescent probe via simple synthesized methods, which can be used in imaging cell even sub-cellular organelles. Two-photon fluorescent probe has become the important tool in cells imaging for micro-environment over one-photon fluo

11、rescent probe, owing to the lower excitation energy, deeper penetration, smaller photon damage and decrease of auto-fluorescence. As the “digestive organs in living cells, lysosome is responsible for dissolution and digestion during cells physiological process with a lot of lysozymes contained in th

12、e acid micro-environment (4.55.5). Dysfunctions of lysosome are related to cells physiological process and many diseases. Intracellular lysosomal viscosity plays a critical role during cellular diffusion-controlled processes, including the transportation and interaction of bio-molecules. Abnormal va

13、riations in intracellular lysosomal viscosity are related to many diseases and pathologies, such as Alzheimer disease and atherosclerosis. So it?s important to design a novel two-photon fluorescent probe for intracellular viscosity, even for intracellular lysosomal viscosity. On the basis of reading

14、 and investigating numbers of literatures, we developed two fluorescent probes, which were characterized by lH NMR3 13C NMR, and ESI mass spectrometry accurately, for viscosity detection. In addition, we further investigated the Vis-UV absorbance spectra, fluorescence emission spectra and two-photon

15、 absorbance cross section for their photo-properties. Moreover, we also obtained good results via confocal two-photon fluorescent biological imaging, fluorescent lifetime imaging and fluorescent vivo imaging in application in bio-imaging. First, we simply introduced structure of fluorescent probe wi

16、th fluorescence emission mechanism, as well as the advantages of two-photon microscopy imaging technology. 万方数据 III Second, we designed a novel quinoline-based two-photon fluorescent probe MCN via introducing a strong electron-withdrawing group dicyanidinyl to quinoline parent. MCN showed a great re

17、sponse to viscosity induced by water-glycerol and micro-environment. MCN possessed a perfect two-photon property due to the great D-TI-A construction which was fonned by electron-donating group methoxy group, conjugated system 6-substituted quinoline group, and electron-withdrawing group dicyanoviny

18、l. Meanwhile, MCN was water-soluble, low cytotoxicity with stable fluorescence emission attributed to the quinoline parent. Moreover, it was confirmed that MCN could perform as an excellent two-photon viscosity fluorescent probe for detecting viscosity variations in HeLa cells qualitatively and dete

19、cting viscosity distribution in HeLa cells quantitatively according to the confocal two-photon fluorescence microscopy imaging and two-photon fluorescent lifetime imaging with good linear relationship between r of MCN and solvent viscosity rj. MCN is a potential candidate of two-photon fluorescent p

20、robe for monitoring micro-viscosity in vivo in zebrafish. Third, we developed a new naphthalimide-based two-photon fluorescent probe Lyso-NP for lysosomal viscosity variations detection. Lyso-NP was constituted with naphthalimide parent, lysosomal targeted group morpholine at UN,9 position, and 4-su

21、bstituted N, N-dimethylamino phenylacetylene. Dimethylamino played the rotor role in the structure owing to its fine electron-donating capacity, thus Lyso-NP could serve as an excellent fluorescent probe for lysosomal viscosity. Lyso-NP possessed a perfect two-photon property due to the great D-31-A

22、 construction which was formed by electron-donating group N, N-dimethylamino, conjugated system 4-substituted naphthalimide group, and electron-withdrawing group morpholine. Meanwhile, Lyso-NP was water-soluble, low cytotoxicity with stable fluorescence emission attributed to the naphthalimide paren

23、t. Moreover, it was confirmed that Lyso-NP could perform as an excellent two-photon viscosity fluorescent probe for detecting viscosity variations in MCF-7 cells qualitatively and detecting viscosity distribution in MCF-7 cells quantitatively according to the confocal two-photon fluorescence 万方数据 IV

24、 microscopy imaging and two-photon fluorescent lifetime imaging with good linear relationship between r of Lyso-NP and solvent viscosity Y. Keywords: two-photon; fluorescent probe; viscosity; lysosome; bio-imaging V 万方数据 Itw . 1 1.1 霞 . 1 1.2 双光子焚光显微技术 . 2 1.2.1 双光子吸收与双光子荧光 . 2 1.2.2 双光子荧光显微技术及其优势 .

25、 4 1.2.3 双光子荧光探针 . 4 1.3 黏度荧光探针 . 6 1.3.1 黏度荧光探针 . 6 1.3.2 亚细胞器定位的黏度荧光探针 . 10 第二章基于喹啉的双光子黏度荧光探针的设计、合成以及性能研宄 . 13 2.1 弓 . 13 2.3 实验仪器及试剂 . 14 2.4 目标探针的合成及结构表征 . 16 2.4.1 焚光探针 (MCN)的合成路线 . 16 2.4.2 荧光探针 (MCN)的合成步骤及结构表征 . 16 2.5 光谱测试条件 . 18 2.5.1 测试溶液的配制 . 18 2.5.2 荧光量子产率的测定 . 18 2.5.3 福斯特 -霍夫曼方程 . 19

26、2.5.4 双光子吸收截面的测定 . 19 2.6 生物测试 . 20 2.6.1 细胞毒性测试 . 20 2.6.2 细胞培养以及共聚焦双光子荧光显微成像 . 20 2.6.3 双光子荧光寿命成像 . 21 2.6.4 小鼠肝脏组织切片共聚焦双光子荧光显微成像 . 21 2.6.5 活体斑马鱼共聚焦双光子荧光显微成像 . 21 2.7 结果与讨论 . 22 2.7.1 探针 MCN 的紫外吸收光谱和荧光发射光谱 . 22 2.7.2 探针 MCN 的荧光寿命曲线和双光子吸收截面 . 24 2.7.3 探针 MCN 的 pH 稳定性测试 . 25 2.7.4 理论计算 . 25 2.7.5 细

27、胞毒性测试 . 26 2.7.6 不同温度下的双光子显微成像 . 27 2.7.7 细胞凋亡过程中的共聚焦双光子荧光显微成像 . 28 2.7.8 荧光寿命成像 . 30 2.7.9 小鼠肝脏组织双光子荧光显微成像 . 31 2.7.10 共聚焦双光子斑马鱼活体荧光显微成像 . 32 2.8 本章总结 . 34 第三章基于萘二酰亚胺的溶酶体定位双光子黏度荧光探针的设计、合成以及性能研宄 35 3.1 弓丨言 . 35 VI 万方数据 3.2 目标探针 (LYSO-NP)的设计 . 35 3.3 实验仪器及试剂 . 36 3.4 目标探针的合成及结构表征 . 38 3.4.1 荧光探针 (Lys

28、o-NP)的合成路线 . 38 3.4.2 荧光探针 (Lyso-NP)的合成步骤及结构表征 . 38 3.5 光谱测试条件 . 39 3.5.1 测试溶液的配制 . 39 3.5.2 荧光量子产率的测定 . 39 3.5.3 福斯特 -霍夫曼方程 . 40 3.5.4 双光子吸收截面的测定 . 40 3.6 生物测试 . 41 3.6.1 细胞毒性测试 . 41 3.6.2 细胞培养以及共聚焦双光子荧光显微成像 . 41 3.6.3 溶酶体共定位共聚焦双光子荧光显微 成像 . 42 3.6.4 双光子荧光寿命成像 . 42 3.6.5 小鼠肝脏组织切片共聚焦双光子荧光显微成像 . 42 3.

29、7 结果与讨论 . 43 3.7.1 探针 Lyso-NP 的紫外吸收光谱和荧光发射光谱 . 43 3.7.2 探针 Lyso-NP 的荧光寿命曲线和双光子吸收截面 . 44 3.7.3 探针 Lyso-NP 的 pH 稳定性测试 . 46 3.7.4 细胞毒性测试 . 46 3.7.5 溶酶体共定位荧光显微成像 . 47 3.7.6 药物作用 MCF-7 细胞荧光显微成像 . 48 3.7.7 荧光寿命成像 . 50 3.7.8 小鼠肝脏组织双光子荧光显微成像 . 51 3.8 轉，賊 . 52 第四章总结 . S3 参考文献 . 55 致谢 . 66 攻读学位期间发表的论文 . 67 VI

30、I 万方数据 第一章前言 第一章前言 1.1 概述 对于生命科学领域的研宄一直是科学家们所热衷的课题，不同学科的研究人 员运用着本学科先进的检测手段对这一未知的领域进行探索。目前，化学家们更 加青睐于利用小分子荧光探针检测诸如金属离子、信号传递小分子、细胞代谢活 性小分子等化学物质或是黏度、极性、 pH 等细胞微环境影响因素 1_3。小分子荧 光探针相较于其他检测工具具有设计合成简便、灵敏度高、检测限低等优势，除 此之外，人们还可以利用它来进行实时的荧光显微成像，更加直观地对生命活动 进行观察研究 6j。 小分子荧光探针生物相容性好，能够较易穿透细胞膜，并能够对细胞内的与 生命过程相关联的物质

31、进行快速实时的检测。通过共聚焦显微成像技术的运用， 小分子荧光探针更是能够进行实时的荧光显微成像 目前， “ 些荧光探针除了 能够很容易的进入到细胞中，它们针对不同亚细胞器的特点而 进行的功能设计更 能够让它们特异性的定位到不同的亚细胞器中 8, 9。大部分的小分子荧光探针是 基于传统的荧光团设计而成，例如 BODIPY、 罗丹明、荧光素、香豆素、萘二酰 亚胺等等不过这些多为单光子荧光探针，基于单光子紫外激发 (350-550 nm) 的单光子荧光显微成像技术。遗憾的是，单光子荧光显微技术受限于其激发光能 量高、受细胞自荧光千扰、光毒性大等劣势只能进行浅层的生物组织生物荧光成 像应用 (渗透深

32、度小于 80 (jm)。 在小分子焚光探针的近十来年发展中，双光子焚 光显微技术己经成为小分子荧光探针生 物成像应用领域的主流，主要是因为它具 有高的时空间分辨率、长的荧光观测时间等特点，进而能够进行深层的生物组织 生物荧光成像应用 (渗透深度超过 100 )。开发双光子小分子荧光探针已经成为 近年来荧光探针领域的研究热点 11。 作为和控制物质传递过程相关的重要影响因素，黏度不仅仅在化学相关领域 扮演重要角色，而且在生命科学领域的不同生物体系间的活动中同样起着至关重 要的作用。黏度能够控制生命活动中不同物质之间的传递速率以及多相液体之间 物质的转移传递。例如，细胞内的黏度能够影响细胞生命过程中参与的营养物质 1 万方数据