基因工程及其应用4.ppt

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1、第八章第八章.基因工程及其在医药学中的应用基因工程及其在医药学中的应用 重组重组DNADNA技术技术DNA Recombination Technique 基因工程相关概念基因工程相关概念基因工程相关的酶学基因工程相关的酶学基因工程的载体基因工程的载体目的基因的制备和分离方法目的基因的制备和分离方法载体与目的基因的连接载体与目的基因的连接重组体的鉴定与分析重组体的鉴定与分析隆基因的表达隆基因的表达本章主要内容本章主要内容重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973

2、年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉1. 克隆克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称

3、为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。即无性繁殖。（一）（一）DNADNA克隆克隆2.2.克隆化克隆化(cloning)(1)(1)分子克隆分子克隆( (molecular clonemolecular clone),),即即DNA DNA 克隆克隆 ; ;(2)(2)细胞克隆；细胞克隆；(3)(3)个体克隆（动物或植物）。个体克隆（动物或植物）。技术水平技术水平: : 3. 3. DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质遗传物质与与载体载体DNADNA接合成一具有自我复制接合成一具有自我复制能力的能力的DNAD

4、NA分子分子复制子复制子(replicon)，继而继而通过转化或转染通过转化或转染宿主细胞宿主细胞，筛选出含有目的，筛选出含有目的基因的基因的转化子细胞转化子细胞，再进行扩增，提取获得，再进行扩增，提取获得大量同一大量同一DNADNA分子，也称分子，也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆克隆目的目的: : 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA; 获得感兴趣基因的表达产物（蛋获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）白质）。重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目

5、的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA连接酶连接酶 逆转录酶逆转录酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 (restriction endon

6、uclease(restriction endonuclease, RE), RE)(1) (1) 定义定义识别识别DNA的特异序列的特异序列, , 并在识别位并在识别位点或其周围点或其周围切割切割双链双链DNADNA的一类内切酶的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam Hu与甲基化酶共同构成细菌的限制与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统：限制外源修饰系统：限制外源DNA，保护自，保护自身身DNADNA，稳定细菌遗传性状。，稳定细菌遗传性状。u、（基因工程技术中常用基因工程技术中常用型型）EcoR 属属 种种 株株 序序Escherichia coli RY13株

7、株大肠杆菌大肠杆菌 RY13株的第一种酶株的第一种酶 回文结构回文结构(palindrome) Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口来源不同的限制酶，但能识别和切来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst 同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，后，产生相

8、同的粘性末端，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端2. DNA聚合酶聚合酶3.TaqDNA聚合酶聚合酶 (TagDNA polymerase) 是一种耐热的依赖于是一种耐热的依赖于DNA的的D NA聚合酶，具有聚合酶，具有聚合酶聚合酶活性，该酶

9、最适反应温度为活性，该酶最适反应温度为75 80 合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，进行填补， 标记或标记或DNA序列分析序列分析4.逆转录酶逆转录酶(1)具有完整具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、 35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性外切活性.。 常用于常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等.5. Klenow片段片段6. DNA连接酶连接酶 (DNA ligase)功能功能:催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷磷 酸基和酸基和3 羟基末端之间形成羟基末端之间形成 磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA切口封

10、切口封 合或使两个合或使两个DNA分子或片段分子或片段 连接连接.功能功能:催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基羟基 末端磷酸化，或标记探针末端磷酸化，或标记探针.7. 多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶功能功能: 在在3 羟基末端进行种核羟基末端进行种核 苷酸多聚物加尾苷酸多聚物加尾8.末端转移酶末端转移酶（三）目的基因（三）目的基因 cDNAcDNA (complementary (complementary DNA)DNA)基因组基因组DNA (genomic DNA)DNA (genomic DNA)功能功能: 切除切除5末端磷酸基团末端磷酸基团9.碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （三）基因载体（三）

11、基因载体 (cloning vector)1.1.概念：概念：携带目的基因，实现其无性携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些用的一些DNA分子。分子。来源分类：质粒载体来源分类：质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体人工染色体载体人工染色体载体用途分类：克隆载体用途分类：克隆载体表达载体表达载体 穿梭载体穿梭载体2. 2. 常用载体常用载体: :克隆载体克隆载体(cloning vector)能使插入的外源能使插入的外源DNA序列被复制、扩增序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为而不能表达，这样的载体为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体

12、(expression vector) 使插入的外源使插入的外源DNA序列转录翻译，表达序列转录翻译，表达出多肽链，出多肽链，这样的这样的载体称为载体称为表达载体表达载体。这类载体中含有来源不同的复制子结构，这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备即具备原核细胞原核细胞复制所需的序列结构，又具复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在有能使外源片段在真核细胞真核细胞表达所需的结构表达所需的结构元件和相应的选择标记基因元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受所以能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进类载体直接从

13、一种受体转入另一种受体中进行复制和表达行复制和表达穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector)3.载体具备以下条件载体具备以下条件:1.具有自我复制能力具有自我复制能力具有多个单一限制性酶切位点具有多个单一限制性酶切位点具有选择性遗传标记具有选择性遗传标记分子量小，拷贝数高分子量小，拷贝数高具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性 松弛型的复制子、多克隆位点、松弛型的复制子、多克隆位点、 筛选标记筛选标记. 常见常见:质粒、噬菌体质粒、噬菌体克隆载体必需结构克隆载体必需结构:具有具有复制子复制子，筛选标记筛选标记，位于多，位于多克隆位点的上下游具有转录效率克隆位点的上下游具有转录效率较高

14、的较高的启动子启动子，起始密码子和核起始密码子和核糖体结合位点糖体结合位点，转录终止子转录终止子结结构构表达载体结构特点：表达载体结构特点： 存在于细菌染色体外的能独立复制存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的的双链闭环的DNA分子。分子。质粒质粒 (plasmid)质粒质粒细菌质粒细菌质粒质粒的复制类型质粒的复制类型严谨型（严谨型（strigent plasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主染色体复复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约份拷贝份拷贝松弛型（松弛型（relaxed plasmid):复制不受宿主染色体复制的复制不

15、受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高基因工程常用载体贝数高基因工程常用载体常用质粒载体种类：常用质粒载体种类：pBR322pUCpBR322:人工构建重要质粒人工构建重要质粒优点：具有较小的分子量优点：具有较小的分子量具有两种抗生素抗性基因，可作具有两种抗生素抗性基因，可作为筛选标记为筛选标记具有高拷贝数具有高拷贝数是松弛型质粒是松弛型质粒目目 录录pUC质粒特点：质粒特点：来源于来源于pBR322质粒的复制起质粒的复制起始点始点具有两种抗生素抗性基因，但基因具有两种抗生素抗性基因，但基因内无核酸内切酶位点内无核酸内切酶位点含有大肠杆菌含有大肠杆

16、菌半乳糖苷酶半乳糖苷酶-肽肽段编码基因统称段编码基因统称LacZ基因基因靠近靠近LacZ基因基因端有一段多克隆位点，端有一段多克隆位点，影响影响LacZ基因功能基因功能含有一个调节含有一个调节 LacZ基因表达基因表达的阻遏蛋白基因的阻遏蛋白基因LacIpUC质粒质粒优点：优点：具有更小的分子，更高的拷数具有更小的分子，更高的拷数适于组织化学检测重组体适于组织化学检测重组体噬菌体噬菌体(phage) 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）噬菌体噬菌体(phage)载体系

17、统分类：载体系统分类： M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列左臂左臂右臂右臂非必需序列非必需序列重组分子重组分子左左臂臂右右臂臂不能包装的病毒颗粒左臂左臂右臂右臂插入单一酶切位点或插入单一酶切位点或一对内切酶位点一对内切酶位点噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统左臂左臂右臂右臂粘性质粒粘性质粒( (cosmidcosmid) )结合质粒克隆载体和结合质粒克隆载体和噬菌噬菌体克隆载体的优点体克隆载体的优点结构：质粒粒DNA接上接上噬菌体噬菌体 粘性末端粘性末端(cos).粘性质粒粘性质粒(cosmid)：具有具有噬菌体噬菌体 粘性末端

18、特性粘性末端特性具有质粒耐药性标记具有质粒耐药性标记具有多个限制性酶切位点具有多个限制性酶切位点具有高容量的克隆能力具有高容量的克隆能力接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，接上真核细胞复制子和启动子及选择标记，就能在真核细胞中存在和表达就能在真核细胞中存在和表达粘性质粒的特点粘性质粒的特点l酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)l细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)l动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病

19、毒）腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其它其它（四）目的基因（四）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组基因组DNA (genomic DNA)（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 1. 化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.2.基因组基因组DNADNA文库文库(genomic DNA (genomic DNA library)library)3. cDNA3. cDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)4. 4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(po

20、lymerase chain (polymerase chain reaction, PCR)reaction, PCR)（见第（见第2222章）章） 化学合成获取化学合成获取目的基因目的基因* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列基因组基因组DNA文库获取文库获取目的基因目的基因(genomic DNA library)组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细

21、胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录EcoR IGenomic LibraryInfect cells限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20

22、 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因(cDNA library)mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录引物引物cDNAcDNA 文文 库库 基于核酸杂交的筛选基于核酸杂交的筛选; ; 基于抗原抗体反应的筛选。基于抗原抗体反应的筛选。在文库中筛选目的基因原理在

23、文库中筛选目的基因原理 聚合酶链反应获取聚合酶链反应获取(polymerase chain reaction, PCR)5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR基本工作原理基本工作原理目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录 PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5Cn模板模板DNAn 特异

24、性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分（五）目的基因与载体的连接（五）目的基因与载体的连接经限制酶作用于目的基因与载体经限制酶作用于目的基因与载体DNA，在连接酶催化下，来源不同双，在连接酶催化下，来源不同双链链DNA片段，断端重新形成片段，断端重新形成，磷酸二酯键的过程磷酸二酯键的过程连接原理粘性末端连接粘性末端连接平端连接平端连接一端粘性末端与另一端平端连接一端粘性末端与另一端平端连接连接方式：连接方式：方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末

25、端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接粘性末端连接粘性末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一

26、限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录定向克

27、隆定向克隆适用于：限制性内切酶切割产生适用于：限制性内切酶切割产生的平端或粘端补齐或切平形成的的平端或粘端补齐或切平形成的平端平端T4 DNA连接酶催化平端连接连接酶催化平端连接 平端连接平端连接目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的的作用下，在作用下，在DNA片段末片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。再进行粘端连接。同聚物加尾连接同聚物加尾连接

28、5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 5 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体目目 录录由平端加上新的含有由平端加上新的含有限制性酶切限制性酶切位点的位点的接头，再用限制酶切除产生粘接头，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接性末端，而进行粘端连接。 人工接头人

29、工接头(linker)连接连接人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录（六）重组（六）重组DNA导入受体菌导入受体菌受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷受体菌处于受体菌处于感受态感受态(competent) 感受态感受态(competent) : 指细胞在一定的生理状态可指细胞在一定的生理状态可摄取外源性遗摄取外源性遗传物质传物质经体内重组成为染色体中的一部分经体内重组成为染色体中的一部分,导导致受体细胞某些遗传性状的改变致受体细胞某些遗传性状的改变.经人工处理

30、经人工处理能吸收重组能吸收重组DNA分子敏感状态的宿主细胞，分子敏感状态的宿主细胞，称之为人工感受态细胞称之为人工感受态细胞导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)转化转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组以质粒为载体构建的重组DNA分子导分子导入原核细胞的过程入原核细胞的过程.转染转染 (transfection): 以噬菌体或病毒为载体构建重组以噬菌体或病毒为载体构建重组DNA分子导入真核细胞的过程分子导入真核细胞的过程.感染感染 (infection):以人工改造的噬菌体

31、或病毒为载体构建以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建重组重组DNA分子分子,经体外包装成具有感染性经体外包装成具有感染性噬菌体或病毒颗粒后噬菌体或病毒颗粒后,借助于噬菌体或病借助于噬菌体或病毒的蛋白外壳将重组毒的蛋白外壳将重组DNA分子注入细菌分子注入细菌或真菌细胞或真菌细胞,从而使目的基因得以复制的从而使目的基因得以复制的过程过程.（七）重组体的筛选（七）重组体的筛选(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹1. 直接选择法直接选择法 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶

32、免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等.限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱.双脱氧终止法测序（双脱氧终止法测序（sanger法法）目目 录录( (插入失活法插入失活法) )抗药性标记选择抗药性标记选择组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录原原位位杂杂交交目目 录录核核酸酸杂杂交交Southern印迹印迹目目 录录鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出目目 录录重组重组DNA技术操作的主要

33、步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶

34、切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 （八）克隆基因的表达（八）克隆基因的表达将外源目的基因克隆到表达载体上，将外源目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞的过程称为外源基因的表导入受体细胞的过程称为外源基因的表达达外源基因的表达外源基因的表达外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，离纯化等过程，表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化外源基因的表达步骤外源基因的表达步骤外

35、源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核表达系统就是将克隆的外源原核表达系统就是将克隆的外源基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、基因导入原核细胞，使其在细胞内快速、高效地表达基因产物，主要有大肠杆菌、高效地表达基因产物，主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等芽孢杆菌及链霉菌系统等 E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用组成：选择标志组成：选择标志强启动子强启动子翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点原核表达体系原核表达体系表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质不能加工表达的真核

36、蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白E.coli表达体系的不足表达体系的不足 外源基因在原核细胞中的表达1融合型表达蛋白融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿所谓融合型表达是指将外源目的基因与宿主结构基因相拼接构建成融合基因进行表主结构基因相拼接构建成融合基因进行表达这样产生的蛋白质的达这样产生的蛋白质的N末端为宿主基末端为宿主基因序列（可以是原核因序列（可以是原核DNA或其它或其它DNA序列）序列）编码，编码，C末端由外源目的基因编码。末端由外源目的基因编码。 2非融合

37、型表达蛋白非融合型表达蛋白 是指外源目的基因不与宿主基因融合，是指外源目的基因不与宿主基因融合，直接从起始密码直接从起始密码AUG开始在原核调控元开始在原核调控元件控制之下表达外源基因蛋白质。件控制之下表达外源基因蛋白质。 非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋非融合型表达的蛋白质具有类似天然蛋白质的结构，其生物学功能也更接近于白质的结构，其生物学功能也更接近于体内的天然蛋白质。但其缺点是容易被体内的天然蛋白质。但其缺点是容易被细菌蛋白酶降解。细菌蛋白酶降解。3分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白 分泌型表达是利用具有信号肽分泌型表达是利用具有信号肽编码序列的分泌型表达载体，将表达编码序列的分泌型表达载体

38、，将表达的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质的蛋白质由细胞质跨膜分泌到细胞基质或细胞周质中。或细胞周质中。 强启动子及其调控序列、强启动子及其调控序列、 SD序列序列 SD序列下游携带有一段信号肽序列。序列下游携带有一段信号肽序列。 常用的信号肽有常用的信号肽有OmpA、PelB、PhoA 和和Hly等。等。分泌型表达载体组成分泌型表达载体组成:需注意是，不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽，需注意是，不同蛋白质的分泌需要不同的信号肽， 大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌目目 录录外源基因在真核表达外源基因在真核表达克隆基因含有克隆基因含有:原核克隆载体的复制子原核克隆载体的复

39、制子 抗性筛选基因抗性筛选基因 限制性内切酶酶切位点序列，限制性内切酶酶切位点序列， 真核表达载真核表达载体体真核表达载体大多是穿梭载体真核表达载体大多是穿梭载体. 表达基因表达基因 真核细胞的启动子、增强子、真核细胞的启动子、增强子、 剪接信号、转录终止信号剪接信号、转录终止信号 PolyA化信号化信号 遗传选择标记等组件，遗传选择标记等组件，真核表达体系：真核表达体系：酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞真核表达体系优点：真核表达体系优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰可适当修饰,表达的蛋白质表达产表达的蛋白质表达产物分区域积累物分区域

40、积累真核细胞具有翻译后加工系真核细胞具有翻译后加工系 统，可进行糖基化、磷酸化、统，可进行糖基化、磷酸化、 乙酰化等修饰，使表达蛋白乙酰化等修饰，使表达蛋白 形成正确的天然构象，具有形成正确的天然构象，具有 完整的生物学活性。完整的生物学活性。某些真核细胞可将外源基因表达产物某些真核细胞可将外源基因表达产物 直接分泌至细胞培养基中，简化了分直接分泌至细胞培养基中，简化了分 离纯化的操作。离纯化的操作。真核表达体系真核表达体系缺点：缺点：操作技术难操作技术难费时费时经济经济目目 录录表达载体导入真核细胞方法表达载体导入真核细胞方法载体转染载体转染 病毒感染病毒感染 目目 录录磷酸钙转染磷酸钙转染

41、DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 转染方法：转染方法： 利用利用DNA重组技术生产重组人胰岛素重组技术生产重组人胰岛素一、人胰岛素的生产方法一、人胰岛素的生产方法（一）直接提取法（一）直接提取法（二）化学合成法（二）化学合成法（三）化学转型法（三）化学转型法 （四）（四）DNA重组技术制备法重组技术制备法重组技术与医学的关系重组技术与医学的关系（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆根据基因定位克隆疾病基因疾病基因,并研究并研究其性质，而认识疾病的分子机制。其性质，而认识疾病的分子机制。（二）生物制药（二）生物

42、制药 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤

43、抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目目 录录基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，分子生物学及分子遗传的技术和原理，在在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。及基因的置换、缺失或插入等突变。(三三)基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断基本过程基本过程分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA

44、片片断断区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常镰刀型红细胞贫血镰刀型红细胞贫血先天愚型先天愚型（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。治疗的目的。体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)基因治疗方式基因治疗方式1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防