最新发酵工程第四章发酵工业的无菌技术幻灯片.ppt
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1、进入夏天,少不了一个热字当头,电扇空调陆续登场,每逢此时,总会进入夏天,少不了一个热字当头,电扇空调陆续登场,每逢此时,总会想起那一把蒲扇。蒲扇,是记忆中的农村,夏季经常用的一件物品。记想起那一把蒲扇。蒲扇,是记忆中的农村,夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡,每逢进入夏天,集市上最常见的便是蒲扇、凉席,不论男女老忆中的故乡,每逢进入夏天,集市上最常见的便是蒲扇、凉席,不论男女老少,个个手持一把,忽闪忽闪个不停,嘴里叨叨着少,个个手持一把,忽闪忽闪个不停,嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”,于是三,于是三五成群,聚在大树下,或站着,或随即坐在石头上,手持那把扇子,边唠嗑五成群,聚在大树下,或站着
2、,或随即坐在石头上,手持那把扇子,边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳,热得满头大汗,不时听到边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳,热得满头大汗,不时听到“强子,别跑强子,别跑了,快来我给你扇扇了,快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套,跑个没完,直到累气喘吁吁,。孩子们才不听这一套,跑个没完,直到累气喘吁吁,这才一跑一踮地围过了,这时母亲总是,好似生气的样子,边扇边训,这才一跑一踮地围过了,这时母亲总是,好似生气的样子,边扇边训,“你你看热的,跑什么?看热的,跑什么?”此时这把蒲扇,是那么凉快,那么的温馨幸福,有母亲此时这把蒲扇,是那么凉快,那么的温馨幸福,有母亲的味道!蒲扇是中国传统工艺品,在我国
3、已有三千年多年的历史。取材的味道!蒲扇是中国传统工艺品,在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树,制作简单,方便携带,且蒲扇的表面光滑,因而,古人常会在上于棕榈树,制作简单,方便携带,且蒲扇的表面光滑,因而,古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名,实即今日的蒲扇,江浙称之为面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名,实即今日的蒲扇,江浙称之为芭蕉扇。六七十年代,人们最常用的就是这种,似圆非圆,轻巧又便宜的蒲芭蕉扇。六七十年代,人们最常用的就是这种,似圆非圆,轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今,我的记忆中,它跨越了半个世纪,也走过了我们的扇。蒲扇流传至今,我的记忆中,它跨越了半个世纪,也走过
4、了我们的半个人生的轨迹,携带着特有的念想,一年年,一天天,流向长长的时间隧半个人生的轨迹,携带着特有的念想,一年年,一天天,流向长长的时间隧道,袅道,袅B. 霉菌霉菌PenG:绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶,而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期,染有能产生青霉素酶的杂菌,都能使青霉素迅速破坏。青霉素水解酶青霉素水解酶上升,上升,PenGPenG迅速破坏,发酵一无所迅速破坏,发酵一无所获。获。柠檬酸柠檬酸:pH2.0pH2.0,不易染菌,不易染菌,主要防止前期染菌主要防止前期染菌。链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所得,但也会造成不
5、同程度的危害。如杂菌大量消耗营养,干扰生产菌的正常代谢;改变pH,降低产量。灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制霉菌,对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。青霉素:怕染细短产气杆菌青霉素:怕染细短产气杆菌链霉素:怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素:怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌四环素:怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素:怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌柠檬酸:怕染青霉菌柠檬酸:怕染青霉菌肌苷(酸):怕染芽孢杆菌肌苷(酸):怕染芽孢杆菌谷氨酸:怕染噬菌体,易造成连续污染谷氨酸:怕染噬菌体,易造成连续污染C. C. 酵母菌酵母菌: : 易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌 D.
6、疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深层培养,这是一类不加提纯而直接使用的产品,在其深层培养过程中,一旦污染杂菌,不论死菌、活菌或内外毒素,都应全部废弃。因此,发酵罐容积越大,污染杂菌后的损失也越大。污染其它杂菌有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫,即使添加消泡剂也无法控制逃液,影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸,致使pH下降,使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌,由于芽孢耐热,不易杀死,往往一次染菌后会反复染菌。 由于接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且容易污染杂菌。如在此阶段染菌,应将培养液全部废弃。(2)不同染菌对发酵的影响 1)种子培养期染菌 2)发酵前期染菌)发酵
7、前期染菌发酵前期最易染菌。原因 发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;且还未合成产物(抗生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。措施 如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种再用。3)发酵中期染菌)发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸,培养液产酸,培养液pHpH下降;糖、氮消耗快,发酵液发粘,下降;糖、氮消耗快,发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产菌丝自溶,产物分泌减少或停止,有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭,产生大量泡
8、生的产物分解。有时也会使发酵液发臭,产生大量泡沫。沫。措施措施 降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,或者况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐,抑制杂菌。菌罐,抑制杂菌。4)发酵后期染菌)发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素,对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多,对生产影响不大。如果染菌严重,又破坏性较大,可以提前放罐。1)发酵染菌对过滤的影响染菌的发酵液一般发粘,菌体大多数自溶
9、,所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼,导致过滤困难。污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异,如污染霉菌时,影响较小,而污染细菌时很难过滤。由于过滤困难,过滤时间拉长,影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用,破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率,直接影响提取总收率。丝状菌发酵被产酸菌污染:丝状菌发酵被产酸菌污染:pHpH不断下降,菌丝大量自溶,不断下降,菌丝大量自溶,发酵液粘度增加,过滤困难发酵液粘度增加,过滤困难 预处理方法:预处理方法:将发酵液加热后再加助滤剂;先加絮凝将发酵液加热后再加助滤剂;先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀剂使蛋白质凝聚后沉淀杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发
10、酵后处理过程中采用溶杂菌分泌较多蛋白质杂质时,对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生媒萃取的提取工艺非常不利,使水相和溶媒之间极易发生乳化乳化染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用有机溶剂萃取的提炼工艺,则极易发生乳化,很难使水相和溶剂相分离,影响进一步提纯。采用直接用离子交换树脂的提取工艺,如链霉素、庆大霉素,染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面,或被离子交换树脂吸附,大大降低离子交换树脂的交换容量,而且有的杂菌很难用水冲洗干净,洗脱时与产物一起进入洗脱液,影响进一步提纯。u显微镜检查法显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需
11、要一定时间u平板划线培养或斜面培养检查法:菌落平板划线培养或斜面培养检查法:菌落 噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法:噬菌斑u肉汤培养检查法肉汤培养检查法 u发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断DODO2 2水平异常变化水平异常变化pHpH异常变化异常变化尾气尾气COCO2 2异常变化异常变化 双双层层平平板板法法底层平板(底层平板(2琼脂培养基琼脂培养基10mL)上层平板上层平板上层培养基(上层培养基(1琼脂培养基琼脂培养基5mL)宿主菌悬液(对数期菌液宿主菌悬液(对数期菌液0.2mL)噬菌体试样(合适稀释液噬菌体试样(合适稀释液0.1mL)混匀混匀3710
12、余余h计数噬菌斑计数噬菌斑12主要原因:主要原因: 种子带菌种子带菌 无菌空气带菌无菌空气带菌 设备渗漏设备渗漏 灭菌不彻底灭菌不彻底 操作失误操作失误 技术管理不善技术管理不善 日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率%种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶 0.48夹套穿孔 12.36盘管穿孔 5.89接种管穿孔 0.39阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏 1.54其它设备渗漏 10.13操作原因 10.15 原因不明 24.94(1)种子带菌及其防治发酵前期种子带菌又分为种
13、子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理,严格无菌操作,种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。l培养基及器具彻底灭菌灭菌锅使用l避免菌种在移接过程中受污染无菌室l避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污染无菌室要求无菌室要求在无菌室中装有紫外灯,打开紫外灯,照半小时,关灯后15分钟再接种。用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、拖地.接种时必须在超净台上操作,超净台装有一台鼓风机,进风口有一粗过滤器,出风口有高效过滤器,保证无菌风从超净台吹出,外界有菌空气不可能进入接种区域,保证无菌条件。接种人员必须穿好无菌服,戴好口罩,手用酒精棉球擦干净。(2 2)过
14、滤空气带菌及其防治)过滤空气带菌及其防治从日本工业技术院分析空气带菌而造成的染菌为19.96。国内外空气除菌技术虽已有较大改善,但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂,环节多,不慎便会导致空气除菌失败。p正确选择采气口p保持过滤介质的干燥p设计和安装合理的空气过滤器(3 3)设备渗漏或)设备渗漏或“死角死角”设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现,这类染菌占33.85。所以说加强设备本身及附属零部件的严密度检查,对制服染菌是极其主要的,也是重要的。 好气性机械搅拌发酵罐是密封式受
15、压设备,主要部件包括:罐身轴封消泡器搅拌器联轴器中间轴承挡板空气分布管换热装置人孔以及管路等u发酵罐的发酵罐的“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件撑件 口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、口:人孔(或手孔)、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口进料管口 发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造成造成“死角死角” 消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装消除方法:加强清洗并定期铲除污垢;安装放汽边阀放汽边阀u管道安装
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