最新发酵——菌种的来源ppt课件.ppt

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1、第一节 微生物的特性及工业微生物的要求一、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长三、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌三、常用的基因表达系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白

2、的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套表达理论及技术.(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长迅速，营养要求不高，易培养；q 安全性好；q 比哺乳动物细胞操作简单；q 具有一定的修饰蛋白的能力。 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有

3、大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：第三节 自然界中有目的微生物分离的原则一、菌种分离的一般过程土样的采取土样的采取 预处理预处理 培养培养 菌落的选择菌落的选择 产品的鉴定产品的鉴定如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的：目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物问题问题：二、采样时要注意的问题q 气候、水分、空气q 来源要广q 结合产品的特点

4、q 标签：地点、时间、气候等富集的三种方案：q 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，表2-2 （P31）但主要是通过培养的方法定向培养的富集方法1、底物2、pH条件3、培养时间4、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。四、菌落的选出q 从产物角度出发

5、在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）q 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中

6、性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈的菌落天，选择有凹陷圈的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型例：醛肟水解酶的筛选例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002), 65-72培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落五、目的微生物富集方法的研究进展q

7、 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。 2002,陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士）q In contrast to this traditional appro

8、ach, modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening, which also enables access to enzymes of nonculturable organisms. By this strategy, for instance, the company Diversa (San Diego, CA, USA) identised 120 unique esterases/lipases from only 16% of the total DNA obtaine

9、d from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 7381第四节 菌株选育、分子改造目的q 提高生产能力提高生产能力q 提高产品质量提高产品质量q 开发新产品开发新产品q 解决生产实际问题解决生产实际问题q 防止菌种退化防止菌种退化方法基因突变：自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等自然选育；生产选育；抗噬菌体菌株选育；自然选育；生产选育；抗噬菌体菌株选育；诱变育种；代谢控制育种；基因重组育种诱变育种；代谢控制育种；基因重组

10、育种自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。变成为正突变。一、自然选育一、自然选育自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的

11、重要措施。重要措施。回复突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变突变问题：问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？自然选育操作步骤：自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落(注意形态的观察注意形态的观察)发酵试验发酵试验二、诱变育种二、诱变育种用各种物理、化学的因

12、素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种称为诱变育种诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂诱变剂物理在：紫外，快中子物理在：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍v超净工作台小型小型X射线衍射仪射线衍射仪Co60射线机（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变剂的作用原理（略）（一

13、）、诱变剂的作用原理（略）压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH（三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤 (p83)（四）、筛选的方法（四）、筛选的方法q 随机筛选随机筛选q 形态形态q 理性化筛选理性化筛选从产物形成的生理生化途径着手，进从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。些特性，称为遗传标记。结构类似物结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节

14、方面可以代替代谢中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。 HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如Thr缺陷型黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g

15、/lF6-16 (leu -, Thr -) 20.8 g/lF9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l三、基因的直接进化三、基因的直接进化(directed evolution)q 突变 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤： 在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。定点突变定点突变错位PCRDNA Shuffling:指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。 基因重组基因重组质粒载体质粒载体DNADNA

16、扩增扩增PCRPCR反应反应重组重组DNADNA的鉴定的鉴定 遗传学方法遗传学方法类类 型型示示 例例特特 性性活性增加倍数活性增加倍数潜在应用领域潜在应用领域抗抗 体体人源抗体人源抗体亲和性亲和性400生物制药生物制药酶酶天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶催化特异性催化特异性10，000生物制药生物制药 -内酰胺酶内酰胺酶抗生素抗性抗生素抗性32，000抗生素抗生素枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E耐热性耐热性65耐热时间耐热时间17200工业酶工业酶细胞因细胞因子子人类干扰素人类干扰素抗病毒抗病毒285，000基因治疗基因治疗肿瘤抑制因子肿瘤抑制因子P5337半衰期半衰期12基因治疗基因治疗代谢途代谢途径径砷酸盐代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒砷酸盐解毒40生物制药生物制药汞代谢途径汞代谢途径汞解毒汞解毒12生物制药生物制药部分部分DNA Shuffling技术的研究成果技术的研究成果主要应用：酶学性能的提高:q pHq 温度q 有机溶剂生理环境工业催化环境q 底物专一性脂酶拆分2-甲基癸酸硝基苯酯例：PLAPLA光学拆分选择性(%)2 31 57 75 81 905次错位PCR 2次定点突变Reetz (1997) Liebeton(2000) 45 结束语结束语