组织化学技术教程3.ppt

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1、组织化学技术教程3 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、一、 核酸（核酸（DNA和和RNA） （一）（一） 化学特性化学特性 1分布： DNA （细胞核内）（细胞核内） RNA（核仁（核仁10% ；细胞质；细胞质-核糖体核糖体90%） 2 分子结构：戊糖戊糖 + 磷酸磷酸 + 碱基碱基特点：特点： 大量的磷酸基团大量的磷酸基团酸性酸性 （嗜碱性的基础）（嗜碱性的基础） 戊糖戊糖被盐酸水解被盐酸水解醛基醛基 （成为（成为Feulgen法显示核酸的基础

2、）法显示核酸的基础） 戊糖被盐酸水解醛基 （成为Feulgen法显示核酸的基础） 可以完全水解或部分水解 可以用RNAase或DNAase消化 对照实验（对照实验（） （一）（一） 显示方法显示方法 1 福尔根（福尔根（Feulgen）反应显示）反应显示DNA 原理原理 在在60温度下，将温度下，将DNA用用1N盐酸水解，盐酸水解，DNA双链打开成单链，先释双链打开成单链，先释出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛出碱基，然后脱氧核糖释出醛基，该醛基与基与Schiff氏液形成紫红色沉淀。氏液形成紫红色沉淀。 Schiff试剂显色原理 碱性品红碱性品红 亚硫酸亚硫酸 白亚黄酸白亚黄酸 （无色试剂，称

3、为（无色试剂，称为Schiff试剂）试剂）方法固定剂的选择可用一般的组织学固定液，常用Carnoy固定液。Carnoy固定液： 纯酒： 氯仿： 冰醋酸 = 6：3：1 (60ml) (30ml) (10ml) 恒冷箱切片机的具体染色步骤如下：恒冷箱切片机的具体染色步骤如下： 切片固定在冰醋酸与纯乙醇（切片固定在冰醋酸与纯乙醇（1：3 V/V） 中中10分钟。分钟。 由乙醇降至蒸馏水中。由乙醇降至蒸馏水中。 用用1N盐酸浸泡。盐酸浸泡。 放入预热到放入预热到60的的1N盐酸中，留盐酸中，留6分钟。分钟。 放入室温的放入室温的1N盐酸中。盐酸中。 放入放入Schiff液试剂，保持在暗处，液试剂，保

4、持在暗处，60分钟分钟 用新配制的用新配制的SO2水浸洗水浸洗3次（脱掉未反应次（脱掉未反应 的的Schiff液）。液）。 蒸馏水浸洗净（必须用蒸馏水洗净无色品红， 否则，残留试剂有色品红）。 脱水透明、封固。结果：核内DNA染为红紫色。对照：仅改变第4步为1N盐酸，室温15分钟（-）。 注意事项 不用醛类固定剂如Bouin、戊二醛、丙烯醛等。 常用Carnoy液、甲醇等。 控制水解时间，不同的固定剂用不同的时间， 如：Carnoy 8分钟；Genker 5分钟； Susa 18分钟 最适条件应自行试验。最适条件应自行试验。 控制温度，一般1N盐酸60； 如果5N盐酸1825度。 保证保证Sc

5、hiff试剂的纯净度。试剂的纯净度。 SO2要新配制，除去多余的要新配制，除去多余的 Schiff液宜用之。液宜用之。 必须对照。必须对照。 2 显示核酸的其它方法 Kurnick甲绿Methylgreen显示DNA法 甲绿派若宁Methy green-Pyronin显示DNA和 RNA法 菊花青铬明矾（GC）显示核酸法 丫啶橙Acridine Orange显示DNA和RNA法 核酸提取法 一、一、 蛋白质（蛋白质（Protein） （一）蛋白质的分子结构（一）蛋白质的分子结构 蛋白质的基本单位是氨基酸，肽键将不同的氨基酸结合在一起，除氨基和羧基之外，还含有其它基团，如：羟基、硫氢基、二硫基等

6、。依其结构特点可分为：酸性氨基酸 和碱性氨基酸 ；芳香族氨基酸：苯丙氨基酸、酪氨基酸；杂环类氨基酸：组氨基酸、色氨基酸、亚氨基酸、脯氨基酸、羟脯氨基酸。 （二）目前应用（二）目前应用 1 用于蛋白质的一般定性 确定是否为蛋白质 确定蛋白质的酸碱性 显示蛋白质的特殊基团 2 用于蛋白质功能定性和定位 （三）染色方法（三）染色方法 目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶目前，研究蛋白质功能定性和定位时多用酶组织化学法、配体组织化学法、配体受体结合法、免疫组化法以受体结合法、免疫组化法以显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法显示特殊的蛋白质。这里仅介绍一般的染色方法。 1四氮化联邻茴香胺法四氮化

7、联邻茴香胺法 （Tetra-azotized-o-anisidine） 应用应用 广泛应用于显示酶的活性广泛应用于显示酶的活性 原理原理 芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（芳香伯胺与亚硝酸作用，在低温下（5）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可）可生成重氮盐，此即重氮反应。重氮盐可与酚类作用生成有色化合物与酚类作用生成有色化合物偶氮化合物。上偶氮化合物。上述反应必须在酸性条件下进行。述反应必须在酸性条件下进行。 本实验，联邻茴香胺在酸性、低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐。四氮盐有两个重氮盐，其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸、色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应，另一个重氮基与酚类或奈

8、类发生偶联反应以增色。因此，可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。 方法方法 1 四氮盐配制四氮盐配制 天平称取联邻茴香胺0.25g（有毒，通 风橱内进行）。 在冰浴下，加入已预冷8%盐酸10ml， 玻璃搅拌，促其溶解，混合后为悬浊液。 称NaNO2 0.15g溶于1ml蒸馏水中（冰浴 下）。在冰浴下，将配好的在冰浴下，将配好的NaNO2溶液分三次倒溶液分三次倒入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻入邻联茴香胺悬浊液内，每次倒入都须玻棒搅动，因产生棒搅动，因产生NO2可有黄烟冒出，至黄可有黄烟冒出，至黄烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（烟停止再倒下一次液体。放入冰箱（4）内，约内，约20

9、分钟，待溶液变为黄色。分钟，待溶液变为黄色。倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣。倾出上清液，勿将沉渣泛起，弃去沉渣。用用NaHCO3细粉（约细粉（约0.50.6g）逐渐加）逐渐加 入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）。入上清液内，边加边搅拌（冰浴下）。以刚果红试纸测中和点，待试纸不变蓝即以刚果红试纸测中和点，待试纸不变蓝即达到中和。收集于标本瓶（或广口瓶）内，达到中和。收集于标本瓶（或广口瓶）内，置冰箱备用。此液不稳定，置冰箱内可保置冰箱备用。此液不稳定，置冰箱内可保存两周，若变为橘红色则失效。存两周，若变为橘红色则失效。 2 偶氮反应偶氮反应Carnoy固定的大鼠肝、肠等石蜡切片。 切片脱蜡至水

10、。切片脱蜡至水。 将切片放入下列溶液中（在冰浴中至将切片放入下列溶液中（在冰浴中至23），）， 浸染浸染10分钟。分钟。用前配制：用前配制： 四氮化联邻茴香胺溶液四氮化联邻茴香胺溶液 4ml0.1巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 （pH9.2） 20ml 24ml 入入1N盐酸（冰浴中盐酸（冰浴中23）浸洗）浸洗10秒，多余盐秒，多余盐 酸以滤纸吸干。酸以滤纸吸干。 入H酸饱和液，浸染30分钟（冰浴或冰 箱内）。H酸饱和液配制：H酸 0.4g 0.1M巴比妥缓冲液 20ml （pH9.2） 过滤后使用！ 蒸馏水冲洗，脱水、透明、封固（树胶） 结果 酪氨酸、组氨酸、色氨酸染成红棕色（+）0.1M巴比妥钠

11、50ml配制 分析天平称巴比妥钠（MW=206.18） 1.0309g 于量瓶内+蒸馏水50ml至刻度即可。 0.1M巴比妥缓冲液，pH9.2（20ml）配 制: 0.1M巴比妥钠 19.1ml 0.1N盐酸 0.9 ml 20 ml2 2其它的显示蛋白质的方法其它的显示蛋白质的方法 米朗反应（Millon Reastion）显示酪氨 酸的方法 酪氨酸酪氨酸羟苯基羟苯基 亚硝酸亚硝酸 亚硝基苯亚硝基苯+Hg有色物有色物 注：胶原蛋白不显色，其它蛋白质都显色（+）二硝基氟苯Dinitrofluorobenzene （DNFB）法法 DNFB与与NH2、SH和酪氨酸产生弱有色反应，和酪氨酸产生弱有

12、色反应， 可被偶氮染料加强。可被偶氮染料加强。 酪氨酸重氮化偶联反应 蛋白质硫氢基DDD法（固定时避免 氧化剂） 铁铁氰化钾反应显示SH基 高甲酸阿尔辛蓝显示SS基法 免疫荧光法显示蛋白质三、碳水化合物 中性多糖糖原 碳水化合物 酸性多糖硫酸软骨素 A、B、 C，肝素、硫酸角 （组织中组织中多糖类多糖类） 质素、透明质酸等 蛋白多糖粘蛋白、唾酸粘蛋白 糖 脂脑苷脂类 组织中糖的种类较多，因此，要特异性地显示各种 糖类必须用抑制和酶水解来对照实验。 本章仅以高碘酸雪夫法（PAS法）说明之，其它的 方法还有Alcian blue法，甲苯胺蓝异染性染色法等。 高碘酸雪夫法高碘酸雪夫法 Periodi

13、cSchiff（PAS）method 原理原理 高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖高碘酸为强氧化剂，它可以氧化多糖 分子内分子内1，2乙二醇（顺式和反式）而乙二醇（顺式和反式）而 产生醛基，此醛基再与产生醛基，此醛基再与Schiff试剂结合即试剂结合即 产生红产生红 紫色。紫色。 方法方法 改良的改良的McManus（1946），），高碘酸雪夫法高碘酸雪夫法标本：标本： Carnoy固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片固定的大白鼠肝、肾、肠石蜡切片 大白鼠肝横冷箱切片（未固定）大白鼠肝横冷箱切片（未固定） 步骤 (1) 切片脱蜡入水（横冷箱切片免）(2) 入0.5%高碘酸水溶液，室温，25分钟(3)

14、蒸馏水涮洗(4) 入Schiff试剂，洗3次，每次2分钟(5) 入SO2水中，洗3次，每次2分钟(6) 自来水洗510分钟(7) 蒸馏水稍洗(8)入Mayer氏苏木精副复染核1分钟（9） 自来水5分钟，换蒸馏水（10）脱水、透明、封固 结果 PAS（+）红紫色或红色；核蓝色 Carnoy固定，糖原原位定位不佳，有 移位现象。 对照 用唾液酸淀粉于37消化2030分钟。 苯甲酰或乙酰化法作对照（抑制法） 注意事项 必须按照规定配方配制试剂，按规定的时间 反应。以避免非特异反应。例如：入高碘酸水溶液时间不宜过长，否则非特异着色。多糖大多都易溶于水，固定时应避免扩散或移位。 冰冻切片+苦味酸福尔马林

15、固定避免扩散或移位。注意溶液的pH值：高碘酸液的pH不应超过5。注意温度。反应宜在25的室温下进行，否则可氧化醛基为羧酸。高碘酸溶液的浓度宜控制在0.5%1%（0.020.1M）浓度过高则会发生非特 异反应。为充分显示多糖中的糖原，可在过碘酸 中加入5%醋酸或纯乙醇固定，但往往有 溶解和扩散。为阻止胶原纤维和网状纤维阳性反应， 可使用还原液，于使用Schiff液之前。 分析结果 PAS反应阳性物质：糖原、中 性粘蛋白、中性唾液性粘蛋白。 四、脂类四、脂类 组织中的脂类 单纯脂类 脂肪酸 醇的化合物（如：甘油三脂等） 复合脂类 磷脂（卵磷脂，脑磷脂）脂类 鞘磷脂 糖脂（脑苷脂，神经苷脂） 衍生脂

16、类 胆固醇 肾上腺素 性激素 显示脂类的基本原理 用易溶于脂类的染料，使之溶于所检的脂质（如脂滴如脂滴）中，使组织内的脂类着色。 常用方法 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼罗蓝法 基本要求 不用石蜡切片。 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好。 方法： 物理法：脂溶性染料，不溶于水，属偶 氮染料。常用苏丹、，苏 丹黑 ，油红O等。 化学方法：硫酸尼罗蓝显示脂肪酸。 选择性提取法（对照）实验举例：苏丹黑B法 原理 苏丹黑为偶氮染料，具有脂溶性，可溶于无水酒精，但不溶于水（常用70%酒精饱和液）。当组织切片入染液时，苏丹黑B便离开染液而溶于组织内的脂质（如脂滴中）使组织内脂类着色。标本：兔肾上腺和睾丸横冷箱切片，10m厚，不固定（或用10%Formalin固定10分钟后水洗）。 方法 入蒸馏水洗 于70%乙醇内涮洗 入苏丹黑B 70%B饱和液，染510分钟 于50%酒精内浸洗 蒸馏水中洗 入Mayer苏木精（复染细胞核）1分钟 自来水冲洗510分钟 入蒸馏水 甘油明胶（或Apathy糖胶）封固 结果 细胞内脂滴均呈黑色