2022年铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中表达及其性质研究报告 .pdf

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1、个人资料整理仅限学习使用铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究岳 明，丁宏标，乔宇中国农业科学院饲料研究所生态饲料研究室，北京 100081）摘要： 【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株，以期获得重组海藻酸裂解酶，并对其性质加以研究。【方法】采用 PCR 的方法，以铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）基因组 DNA 为模板，克隆出约1.0kb 的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列，并将其插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris）表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇 in Pichia pasto

2、ris and Characterizationof the EnzymeYUE Ming, DING Hong-biao, QIAO Yu(Feed Research Institute, ChineseAcademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081 Abstract: 【Objective】The purpose was to clone and express alginate lyase gene( algLof Pseudomonas aeruginosa in Pichia pastoris expression system. 【

3、Method 】Alginate lyase gene of P. aeruginosawas amplified and inserted into pPIC9K expression vector by adding EcoR I site to generate recombinant pPIC9K- algL construct. The positive construct was transformed to Pichia pastoris GS115 cells by PEG method. The AlgL protein was over-produced in P. pas

4、toris induced by methanol. 【Result】The product of recombinant alginate lyase showed a molecular weight of 40 kD on SDS-PAGE with activity of 540Uml-1 at an optimal temperature 40and pH 8.5, respectively. The recombinant AlgL was stable below 45 between pH3.0 and 12.0. The recombinant AlgL was sensit

5、ive to some metal cations negatively including Zn2+, Cu2+ and Fe2+, but Co2+ and Ca2+ promoted it dramatically. The sterilization of ampicilin and kanamycin on P . aeruginosa increased with the help of AlgL. 【Conclusion 】P. pastoris expression system is an efficient way of production of AlgL. The re

6、combinant AlgL has potency as feed additive and antibiotic assistant.Key words: Alginate lyase。 Pichia pastoris 。 Alga oligosaccharides。 Induction expression 精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用0 引言【研究意义】海藻酸盐alginate）是广泛存在于大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖。它的存在对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗营养

7、因子，影响了海藻细胞内营养物质的释放，降低了饲料利用率。另外，海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ）在病灶部位定殖1,2，影响抗生素的扩散和杀菌效果，使铜绿假单胞菌具有较高的抗药性3,4。铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生理后期能产生一种海藻酸盐裂解酶alginate lyase，AlgL ），可催化海藻酸盐 -D-甘露糖醛酸单体间1，4-糖苷键断裂，生成寡聚糖醛酸5,6，降低细菌的黏附能力，从而结束其生命周期。海藻饲料中的海藻酸盐经海藻酸裂解酶降解后，胞内的营养物可被充分质释放出来，利于动物消化吸收，所产生的海藻寡糖还具有改善动物胃肠道微生态环境等活性。因

8、此，海藻酸裂解酶的生产研究对饲料资源与医药开发具有一定的理论与现实意义。【前人研究进展】一些微生物79和海洋动植物1013都可以产生海藻酸裂解酶，早期海藻酸裂解酶主要由天然菌株培养提取5,14。随着基因工程技术的发展，一些物种海藻酸裂解酶基因被克隆和表达1517。 Boyd 等18和 Neal 等19先后于1993 年首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因algL 并在大肠杆菌Escherichia coli ）中进行了表达，证明了它与其它海藻酸代谢相关基因algD-8-44-K-E-G-X-L-I-J-F-A ）位 于 染色 体 上 同一 基 因簇中，在海藻酸代谢过程中起重要作用20。

9、【本研究切入点】原始菌株产酶量非常有限，提取纯化成本高昂，而在大肠杆菌中表达海藻酸裂解酶基因，易受原核表达系统自身局限性的限制，影响产量与活性。巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris ）作为一种分泌型真核表达系统，表达水平高，纯化过程简单，生产成本低21,22，可作为一种高效生产海藻酸裂解酶的手段。【拟解决的关键问题】本研究利用基因工程技术克隆了铜绿假单胞菌algL 基因，将其导入巴斯德毕赤酵母并进行诱导表达，旨在获得一种高效生产海藻酸裂解酶的新途径，进而对表达产物性质以及作为抗生素辅助剂的作用效果进行探究。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1菌株和质粒 铜绿假单胞菌P. aerug

10、inosa ），购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心CGMCC 1.1785 ）；大肠杆菌E. coli ） DH5 菌株由本室保存；毕赤酵母P. Pastoris）GS115 和 pPIC9K 分泌型表达载体购自Invitrogen 公司；质粒pGEM-T Vector购自 Promega 公司。1.1.2酶和试剂 限制性内切酶、T4 DNA 、X-Gal 连接酶为TaKaRa 公司产品；DNA聚合酶购自Tiangen公司；G418 购自 Invitrogen公司；海藻酸钠、葡萄糖醛酸为Sigma 公司产品；氨苄青霉素和卡那霉素为Amresco 产品；其它化学试剂为国产和进口分析纯试剂。1

11、.1.3培养基LB 培养基见文献23 ， YPD 、RDB 、MM 、MD 、BMGY 、BMMY培养基见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。1.2 实验方法1.2.1铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克隆 参照文献 23 方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA 。根据 GenBank No. U27829序列18，以 algL 基因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密码子序列 1023 bp）设计PCR 扩增引物，上游引物序列为5 CGAATTCGCCGACCT GGTACCCCCGCCCGGCTACTA3，下游引物序列为5 CGAATTCGCCCGCTTCCCGCCACG

12、CCCTCAACTTC 3，其中上、下游引物中都引入EcoR 限制性酶切位点 如下划线所示）。以铜绿假单胞菌基因组DNA 为模板，进行PCR 反应，体系为50l：含有约50ng 铜 绿 假 单 胞 菌 基 因 组DNA 1.5 l， 总 浓 度10mmol L-1dNTP 4l，10mmol L-1的上下游引物各1l，10PCR 反应缓冲液5l，5Ul-1pfu DNA 聚合酶0.5l， ddH2O 37l。反应条件为：94预变性5min 后， 94变性50s，58退火50s， 72延伸1min，进行30 个循环，最后延伸5min，反应结束后加入 Taq DNA 聚合酶与dATP 72反应 2

13、0 min，以使平末端带有成为A 突出的黏性末端。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用PCR 扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-T Vector 上，转化大肠杆菌DH5，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，并进行测序鉴定。1.2.2毕赤酵母重组表达载体的构建鉴定正确的pGEM- algL 经 EcoR酶切处理，将切下的algL 基因成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达载体pPIC9K 中，使其位于 -因子信号肽序列的下游，利用PCR 鉴定出正向插入的克隆，并对该质粒进行进一步限制性酶切及

14、测序鉴定。1.2.3毕赤酵母的聚乙二醇PEG ）法转化 接毕赤酵母菌株GS115 单菌落于10ml YPD 中 30， 250300r/min 培养至OD600为 0.61.0，离心收集菌体，用 10 ml Solution 见 Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册）重悬细胞，离心收集菌体，用1 ml Solution 重悬细胞，此时酵母细胞处于感受态，取80l 上述菌液，加入3g 经限制性内切酶Bgl线性化的重组质粒pPIC9K- algL ，加入1 ml Solution ，充分混匀， 30水浴1h，其中每15min 旋涡震荡， 42水浴10min ， 4000r/min离 心 收

15、集 菌 体 ， 加 入1 ml Solution ， 离 心 去 上 清 ， 最 后 加 入100 150 l Solution ，重悬细胞，菌液涂布于固体RDB 平板上， 30培养 24 d 直至转化子出现。1.2.4重组毕赤酵母的筛选和鉴定用灭菌牙签挑取RDB 平板上的转化子分别点种到MM 、 MD和含600 g ml-1G418 的 YPD 平板上， 30培养。在MD上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化子为甲醇利用慢型；在含G418 的 YPD 平板上生长正常的为多拷贝转化子。毕赤酵母基因组DNA的提取参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。以毕赤酵母基因组DNA为模板，利用

16、目的基因特异性引物序列见1.2.1）进行PCR 反应，以确定外源基因的整合情况。1.2.5重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将转化子接种于含3ml BMGY培养基中的12ml 离心管中， 30 220r/min 摇床培养48h。离心收集菌体，用3ml BMMY诱导培养基重悬菌体，30220r/min继续培养，每24h 补加甲醇至终浓度1.0%。每 24h 取样，将培养液于6000r/min离心5min，收集上清酶液，用于初步定性测定酶活力，以确定产酶菌株。将产酶菌株重新接种于50ml 培养基中用于性质研究和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析24。采用3， 5-二硝基水杨酸法测定酶活力25。每24

17、h 取甲醇诱导的产酶菌株酶液100l 与 100 l 1%褐藻酸钠溶液 pH7. 0 的 1/15N 的磷酸缓冲液配制）于试管中混匀，同时以100 l 蒸馏水替代酶液做空白对照实验。置于40水浴反应10 min，冷却，加入3，5-二硝基水杨酸显色剂600l，再沸水浴10min 显色，冷却，用蒸馏水定容至5 ml，混匀，在550nm下测定吸光度用空白调零），OD 值越高酶活力越高。酶活力定义：在一定温度和pH 值下，每分钟催化海藻酸钠水解生成1g 葡糖醛酸的酶量定义为一个海藻酸裂解酶活力单位U）。1.2.6重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定表达产物经Millipore离心过滤脱盐后，在40

18、不同pH 条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力；将重组海藻酸裂解酶液在不同pH 值的缓冲液中40保温30min ，检测剩余的酶活力以最适反应pH 下酶活力为 100%）。将表达产物在pH8.0 不同温度下测定重组海藻酸裂解酶的酶活力；将重组海藻酸裂解酶液在pH8.0 不同温度下分别保温30min ，检测剩余的酶活力以最适反应温度下酶活力为100%）。配制0.1mol L-1的 CoCl2 6H2O、 MnSO4 H2O、CaCl2、 KCl 、NaCl 、 CuSO4、 FeSO4 7H2O、 ZnCl2、MgSO4溶液，将酶液与上述溶液混合使终浓度分别为 1、10 和 50 mmol L-1）后

19、在40保温 30min ，测定酶活力，以未与盐溶液混合，在40保温30min的酶液活力为100%。1.2.7重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与对铜绿假单胞菌耐药性的影响将 1ml 1%的海藻酸钠底物与 500 l 酶液混和，在40下保温6 h，使之充分反应。将反应混和物煮沸灭活后，在展开剂正丁醇甲酸水4 61）中进行薄层层析，凉干后，均匀喷上显色剂甲醇硫酸41）， 100显色5 min。将重组酶、抗生素分别或混和使抗生素终浓度相同）点于铜绿假单胞菌生长平板含 OD6000.6 菌液100 l）上，对比氨苄青霉素和卡那霉素的抑菌效果变化26。精选学习资料 - - - - - - - - - 名

20、师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用2 结果与分析2.1铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克隆及毕赤酵母表达载体的构建以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出1.0kb 左右的algL 基因成熟蛋白编码序列，插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K 中后，测序结果表明插入片段在 pPIC9K 中有正确的阅读框，表达载体pPIC9K-algL 构建成功。2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定通过在MM和 MD 培养基上的培养，得到的转化子大部分为甲醇利用慢型，并在含有600gml-1G418 的 YPD 平板上获得了多个高拷贝转化子。提取重组工程菌菌株

21、基因组DNA ，进行PCR 鉴定，结果表明algL 基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的基因组中 图 1），保证了基因的稳定遗传。2.3 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将初筛有酶活的菌株在诱导培养基中进行表达，每 24h 测酶活力，筛选出一株酶活力最高的毕赤酵母重组工程菌，酶的活力在诱导培养120144h 达到高峰图 2），峰值为540U ml-1左右。 SDS-PAGE 分析结果表明 图 3），表达产物分子量约为40kD。2.4 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定在不同pH 反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力，测得该酶最适pH 为 8.5 左右，并在pH4.012.0 的条件

22、下仍具有60%以上的酶活力。将重组海藻酸裂1.重组酵母基因组PCR扩增产物； 2. DL2000 分子量标准； 3. 原始酵母菌株 GS115基因组 PCR扩增产物1.PCR product of recombinant P. pastoris。 2. DL2000 marker。 3. PCR product of P. pastoris GS115图 1 重组毕赤酵母工程菌株的PCR鉴定Fig.1 Identifation of recombinant P. pastoris by PCR图 2 重组毕赤酵母诱导产酶曲线Fig.2 Curve of recombinantAlgL acti

23、vity produced by P. pastoris1-6. 甲醇诱导 24, 48, 72, 96, 120和 144 小时重组 AlgL 产物。 7. 蛋白质分子量标准。 8. 诱导前上清液1-6. RecombinantAlgL induced within 24, 48, 72, 96, 120, 144h by methanol。 7. Standard protein molecular weight。 8. Supernatant before induction图 3 不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量Fig.3 SDS-PAGE of expressed AlgL wit

24、hin different induction times解酶在不同pH 的磷酸缓冲液中40保温 30min ，检测剩余的酶活力，发现该酶在pH3.012.0 的条件下保温 30min 后仍剩余60%以上的酶活力图 4）。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用图 4 pH 对重组酶活力的影响及pH稳定性Fig.4 Optimum pH and pH stability of the recombinant AlgL在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力，发现该酶最适反应温度为40。将重组海藻酸裂解

25、酶的酶液分别在不同温度下保温30min ，检测剩余的酶活力，结果表明重组海藻酸裂解酶在2045的条件下保温30min 后仍具有75%以上的酶活力，而在50 及 以 上 条 件 下 保 温 30min酶 活 下 降 明 显 图5）。图 5 温度对重组酶活力的影响和热稳定性Fig.5Optimum temperature and thermolstability of recombinant AlgL由图 6 可见，离子浓度为1、10 和 50 mmol L-1的盐溶液对酶活力的影响有明显差异：50mmol L-1的Mn2+、Mg2+、Co2+、 Ca2+、 K+和 Na+对酶活力均有不同程度的促

26、进作用，而在1 和 10mmol L-1浓度下作用不明显，其中50mmol L-1的 Co2+和 Ca2+可将酶活力提高50%以上； Zn2+、Cu2+和 Fe2+对酶活力均有抑制作用，而且浓度越高越明显，其中50mmol L-1的Cu2+与 Fe2+分别使酶活力丧失了近80%和 60%。图 6 金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响Fig.6 Effect of metallic ions on recombinant AlgL activity2.5重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单胞菌耐药性的影响海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解，可产生多种寡糖，其中包括单糖及其它一系列寡糖图 7），由

27、于单糖和其它寡糖的同时产生说明该酶具有外切和内切活性。1. 葡萄糖醛酸； 2，3. 重组酶降解海藻酸钠产物1. Glucuronic acid。 2, 3. Poduction catalyzed by recombinant AlgL图 7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析Fig.7 TLC of production catalyzed by recombinant AlgL在铜绿假单胞菌生长平板上，根据抑菌圈直径大小，终浓度分别为20 mg ml-1和 2 mg ml-1的氨苄青霉素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌效果分别提高 29%和 18%，纯酶液不产生抑菌圈图 8）。精选学习资料

28、 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用a1. 氨苄西林； 2. 重组海藻酸裂解酶与氨苄西林混合物；3. 重组海藻酸裂解酶b 2. 卡那霉素； 2. 重组海藻酸裂解酶与卡那霉素混合物；3. 重组海藻酸裂解酶a 1. Ampicilin 。 2. Blending of ampicilin and recombinant AlgL 。 3. Rcombinant AlgLb 1. Kanamycin。 2. Blending of kanamycin and recombinant AlgL 。 3. Rcomb

29、inant AlgL图 8 重组海藻酸裂解酶对抗生素抗菌效果的影响Fig.8 Effect of ampicilin and kanamycin with recombinant AlgL on Pseudomonas aeruginosa3 讨论本实验克隆的是铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶algL 基因成熟蛋白编码序列，利用DAMAN软件与GenBank 中algL基因序列进行比对，分别与No. U27829 和 L14597 序列具有99.71% 和 99.12的一致性18,19。SDS-PAGE 分析结果显示，表达产物分子量约为40kD ，与文献报道的天然酶基本一致18。重组海藻酸裂解酶活力达

30、540U ml-1左右，远高于近期袁兆慧等报道的活力水平24。本研究利用分泌型毕赤酵母表达系统，可获得较纯的目的蛋白，基本可以排除酵母自身产生蛋白的影响。另外，通过对重组海藻酸裂解酶酶学性质的初步研究，发现该酶的最适反应温度为40，最适pH 为8.5 左右，均高于Alfred报道5，可能与毕赤酵母表达产物的糖基化有关，并且保证了该重组酶在较宽的pH 范围下具较高活性和稳定性。本研究中抗生素在重组海藻酸裂解酶辅助作用下，抑菌效果明显提高，这与 Richard 等使用天然酶所得到的结果相近26，说明重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保护层，使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用，降低了细菌的

31、抗药性与药物施用剂量。不同生物来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一性，本实验以多聚甘露糖醛酸:3979-3985.2 Mark T A, Neal L S. Alginate lyase (AlgL activity is required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, 2005, 187(11: 3869-3872.3 Boyd A , Chakrabarty A M. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseud

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33、e from mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, 1984, 159(3: 958-964.精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页，共 7 页个人资料整理仅限学习使用6 Monday S R, Schiller N L. Alginate synthesis in Pseudomonas aeruginosa: the role of AlgL (alginate lyase and AlgX. Journal of Bacteriol

34、ogy, 1996, 178(3: 625-632.7 Helga E, Frode E, Gudmund S, Bernd H A R, Svein V. Biochemical properties and substrate specificities of a recombinantly produced Azotobacter vinelandii alginate lyase. Journal of Bacteriology, 1998, 180(15: 3779-3784.8 Tomoo S, Miwa O, Yoshio E. Novel alginate lyases fro

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