中国药科大学分子生物学期末复习资料重要资料分章汇总整编.doc

*- 第2章 可移动的遗传因子 1 转座子是谁最早从什么物种中发现的？ 麦克林托克（Barbara McClintock）; 玉米 2 掌握转座子的概念和分布。 概念:细胞内的可移动遗传因子,指可以在同一细胞中基因组内或一个细胞的基因组从一 个位点移动到另一位点的DNA片断。(广义的概念，凡是细胞内可以移动的因子， 都 叫转座子) 分布:病毒、真核生物、原核生物（质粒&基因组） 3 掌握转座子的分类和各类的特点。 ➢ 非复制型转座：转座时，转座子DNA作为一个整体，从原来的供体位置被切割下来，然后转移到染色体的另外一个位置。 ➢ 复制型转座：转座时，原来的转座子DNA不从原来的位置被切割下来，而是在转座的过程中原来的转座子DNA得到复制，并转移到染色体的另外的地方。原来的拷贝“原件”没有发生位移。 ➢ 逆转录转座子：将转座的片段转录成RNA，再通过逆转录酶将RNA反转录成cDNA，插入寄主染色体中。 4 所有转座子都具有的结构特征和共同特点是什么? ➢ 转座子都具有的结构特征：都有一个保守序列、一个或多个开放阅读框，两侧是反向末端重复序列（反向重复序列为转座子所必须，是转座酶识别的底物） ➢ 共同特点： 1 两端具有末端反向重复序列 2 转座后靶位点重复是正向重复 3 编码一些与转座有关的蛋白 4 可以在基因组中移动 5 最简单的转座子的结构特征。 ➢ 最简单的转座子 ：不含有任何的宿主基因，常被称为插入序列（IS），这种插入序列是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。 ➢ IS的结构特征：DNA的两个末端是反向重复序列（又称倒置重复序列），中间是一个阅读框，编码一个与转座有关的转座酶基因。除此之外，IS序列中没有其他的基因。 6 什么是复合转座子。 ➢ 复合转座子的概念：是一类比较复杂的转座子, 带有一些抗药性基因或其他宿主基因，其两端多数是高度同源的或相同的IS序列（反向重复区）（少数是正向重复序列）。 PS: IS序列插到某个功能基因的两端就产生了复合转座子。复合转座子中的IS序列不能单独自由移动，其功能已经被修饰，只能和复合体一起移动。 7 TnA家族转座子具有什么特点？ ➢ TnA转座子的特点： 1. 末端没有IS序列，而是一个38 bp的反向重复序列； 2. 体积一般较大（5000 bp以上）； 3. 转座子带有3个基因，其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR)，其他两个是转座作用必须的转 座酶和解离酶。<复制型转座> 8 为什么转座子的插入位点两端都有同向重复序列？ ➢ 同向重复序列存在原因： 　　转座时有一个普遍的特征就是受体分子中有一段很短（3－12 bp）、被称为靶序列的DNA会被复制一次，插入的转座子就位于两个重复的靶序列之间。这种靶序列的同向重复序列是由于某种限制型内切酶的切割造成的。 　　IS转座先由转座酶交错切开宿主靶位点，然后IS插入连接，余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，使两端形成短的同向重复序列，IS转座后的特征结构是：末端是反向重复序列，临近末端的旁侧则有宿主DNA的短的正向重复序列。（转座酶具有限制性内切酶活性，不同转座酶切割形成的粘性末端不同） 　　 9 原核细胞中的转座因子有哪些常见的类型？各自特点？ ➢ 原核细胞中的转座因子： ☆插入序列 （IS）： 1. 是最简单的转座子，是细菌基因组DNA中的正常组分。其两端都有反向重复序列（为转座 酶识别所需；重复序列只是类似，并非完全相同），中间的编码区长度为1000 bp左右， 只编码转座酶，除此之外无其他任何基因 2. 对靶点的选择有几种方式：随即选择，热点选择和特异位点选择。 ☆类插入序列(只存在于转座子中的插入序列称为类IS因子)： 1. 这类转座子不单独存在，而是存在于复合转座子的两端。 2. 经过修饰，已经不能够单独移动了，只能和复合转座子的其他成分一起移动。 3. 结构和IS类似，如IS10R、IS50R等。 PS: 类IS序列与IS序列最根本的区别是，类IS序列只存在于复合转座子的两端，但不可自身转座，原因是它失去了编码自身转座酶的能力 ☆复合型转座子： 1. 比IS长的多，中心区域编码抗生素基因或其他宿主基因。 2. 两端的组件由IS和类IS组成，有的两端组件相同，有的不同，有的反向相反，有的方向 相同，有的两个组件均有功能，有的只有一个有功能。 ☆TnA家族： 1. 这类家族长度约为5000 bp，两端具有IR（反向重复），而不是IS。 2. 中部的基因不仅编码抗性基因，还编码转座酶和解离酶。这是一种复制型转座子。末端反 向重复长度是38 bp，产生的靶位点是5 bp的正向重复。 10 玉米中的最常见的转座子系统是什么？ Ac/Ds系统 （激活-解离系统） ： ➢ 激活因子Ac和解离因子Ds属于同一家族控制因子 ➢ Ac是自主因子，编码有活性的转座酶，能发生自主转座 ➢ Ds是非自主因子，与Ac同源，只是不同程度缺失了中间序列，失去转座酶的功能，但是 两末端IR（反向重复序列）存在并且完整。它本身不能转座，但有Ac存在时通过反式转 座酶激活而转移到新的位置。真核生物转座因子通常以非复制方式转座，而且总是只转移到邻近的位置。玉米的Ds因子插入新靶位点之后，原来位置上即失去Ds因子。结果可造成染色体断裂或重排，由此引起显性基因丢失，隐性基因得以表达。（eg.紫白玉米粒） 11 什么是逆转录转座子？ ➢ 逆转录转座子：是指基因组中的双链DNA，可以在基因组内发生转座而移动。（但与DNA转座子不同，逆转录转座子转座时先将自身的DNA序列转录成RNA，然后再反转录成DNA，插入宿主基因组中。） ➢ 逆转座子一般分为2类：病毒类超家族和非病毒类超家族 12 逆转录转座与复制转座有什么异同？ ➢ 异：逆转录转座子转座时先将自身的DNA序列转录成RNA，然后再反转录成DNA，插入宿主基因组中 ➢ 同：逆转录转座子在插入位点两侧也有正向重复序列，这是所有转座子的共同特征 PS：转座有两种方式：复制转座和非复制转座 ➢ 在非复制型转座中只有转座酶参与。 ➢ 在复制型转座中，转座酶（transposase）作用于原来的“原件”，而解离酶(resolvase)作用于复制的转座子。 ➢ 复制转座的基本过程： 　　也称为对称模型，转座发生开始时，由转座酶在转座子两端交错切开产生2个单链切口(nick)，同时在受体分子的位点处也被交错切开产生2个切口，这样一共有4个切口，它们交错连接，形成复合物，称为共整合体(cointegrate)，其中包含有2个类似复制叉的结构 随后它们分别进行复制，填补空隙，最后复合物分开形成2个独立的分子。这些步骤由解离酶完成。在这个过程中，转座子的序列被复制一次，转移到受体分子上，完成转座。 13 什么是质粒？什么叫R质粒?（见笑笑打印第一页背面） 14 掌握一些概念：低拷贝质粒和高拷贝质粒，严紧型复制控制”的质粒和“松 弛型复制控制，质粒的不相容性，结合型质粒，自主转移质粒，非结合型质 粒，2μm质粒（见笑笑打印第一页背面） 15 DNA变异主要有哪两条途径？ ➢ DNA变异有两条途径：突变和遗传重组，它们都会引起遗传物质的改变进而引起蛋白质的改变，最终通过自然选择得以保存并遗传下去。 PS: 1. DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新组合，叫做遗传重组，或叫基因重排。 2. 基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。 16 为什么说重组在生物学中处于中心地位？ 　　突变只能使基因组在小范围内变动，不会产生大的变化，只有通过重组才能使基因组的变化加大，增加进化的潜能。重组使有害和有利的突变不断发生组合，从而除去有害的基因突变，保留有利的突变，使生物体对变化的境有对应能力。 ➢ 遗传重组不仅仅发生在代与代之间，个体基因组也可以发生重排，使基因的表达发生改变，在同一个个体的细胞之间产生遗传基因的多样性，如抗体的产生等。 ➢ 重组不仅仅发生在减数分裂和体细胞的核基因中，也发生在线粒体基因组、叶绿体基因组、噬菌体整合过程中以及转座子的转座中等。 ➢ 所有的有机体都有一些基因重组的机制，说明重组对于物种生存的重要性。 ➢ 重组是遗传物质变异的来源之一，可以使不利基因合有利基因分离，提供一种使有利基因得以保存，有害基因得以清除的方式，同时在DNA的修复中也起重要作用 17 根据重组机制的不同可以将重组分为哪四种类型？ √同源重组 √位点特异性重组 √转座重组 √异常重组 18 什么叫同源重组？有什么特点？在细胞中哪些生物学过程会涉及到同源重 组？ ➢ 概念：同源重组又称一般性重组，它是由两条同源区的DNA分子通过配对，链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程。（另：同源重组是指发生在两条DNA的同源序列之间,涉及的是大片段同源DNA序列的交换。只要两条DNA序列相同或相近就可以在序列任一点发生同源重组。） ➢ 特点： a 在交换区域有相同或相似的序列。 b 双链DNA分子之间互补碱基进行配对。（减数分裂中，两个双链的DNA分子通过链互补的碱 基对被维系在一起，叫做联会。但实验表明，重组不仅仅是碱基配对。） c 在同源重组中有多种酶参加，保证双螺旋的断裂、修复、连接、重组体的释放等。 d 形成异源双链区 ：在重组部位，配对的双链是来源于不同的DNA分子形成的，这个部分称 为异源双链（hetero duplex），或称杂种DNA。 PS: ➢ 同源的2个DNA分子可以在任何地方发生重组 　　同源重组是一种细胞内最常见的重组类型，发生在DNA的同源序列之间，真核生物减数分裂时的染色单体之间的交换、某些低等真核生物和细菌的转化、转导、接合，噬菌体的重组，以及DNA的复制修复等均与这种重组有关。 19 掌握一些概念：异源双链区，Holliday连接体，分支迁移，Holliday连接体 的拆分。(笑笑笔记本1) ➢ 异源双链区：在重组部位，配对的双链是来源于不同的DNA分子形成的，这个部分称为异源双链，或称杂种DNA ➢ Holliday连接体：将要发生重组的两个DNA分子必须首先对齐。在对应的同一部位的两个单链产生断裂，断裂产生的单链游离末端彼此交换，每一条链同另外的DNA分子的互补序列配对形成一个异源双链，然后末端彼此连接产生一个十字结构，叫做Holliday连接体 ➢ 分支迁移：在一些酶和其他蛋白的作用下，Holliday连接体还可以沿着DNA链通过氢键的断裂形成而发生左右移动，这叫分支迁移(branch migration). ➢ Holliday连接体的拆分： 1. 最终这个连接2个DNA分子的Holliday连接体要进行“拆分”，使得两条DNA链彼此分 开，重新成为两条各自独立的DNA双螺旋。 2. 在蛋白和酶的作用下，Holliday连接体进行重排而改变链的彼此关系（这一步叫做 Holliday连接体的分离或离析）。有两种结果完全不同的重排方式。 3. 一种结果是以上下方向切开Holliday连接体(垂直分离)，这种切割发生在整个过程一直 保持完整的一对同源链上，至此所有的4条链全部发生过断裂。(见下图1) 4. 另外一种切割方式是水平切割，发生在重组过程中已经被切开一次的一对同源链上，原来 保持完整的2条同源链仍然保持完整。(见下图2) 20 Holliday 模型是如何解释同源重组发生过程的？(笑笑笔记本1) Holliday模型内容： （1）2个同源的DNA分子相互靠近 （2）2个DNA分子各有1条链在相同的位置被一种特异性的内切酶切开； （3）被切开的链交叉并与同源的链连接，形成χ（chi）状的Holliday连接。 如果2个DNA 之间进行180的旋转，可得到它的异构体； （4）Holliday连接的拆分。 Holliday连接的拆分方式有两种，产生与原来完全相同的两个非重组DNA或产生重组的DNA。 Holliday模型(双链入侵模型)用于解释具有相同或相近序列的两条同源双链分子之间的重组，也可以适用于具有有限同源区的两条不同的分子，或含有两个相互同源区域而可以自我重组的单个分子 。 1. 两个同源染色体DNA排列整齐。 2. 在对应的同一部位的两个单链产生断裂，断裂产生的单链游离末端彼此交换，每一条链同另外的DNA分子的互补序列配对形成一个异源双链，然后末端彼此连接产生一个十字结构，叫做Holliday连接体。（4条染色单体通过一个点连接在一起） 3. 在一些酶和其他蛋白的作用下，Holliday连接体还可以沿着DNA链通过氢键的断裂形成而发生左右移动，这叫分支迁移。分支迁移的结果大大增加了异源双链的长度。 4. Holliday连接体切开并修复，形成两个双链DNA。切开的方式不同，所得到的重组产物也不同。如果切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体中含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，成为片段重组体；但如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链两侧来自不同亲本DNA,称为拼接重组体 ◇Holliday模型特点： Holliday模型又叫做双链入侵模型，因为该模型中，每一个DNA分子有一条链入侵到另外一个DNA分子中，这样就可以说明异源双链区的来源。但是本模型要求重组时两个DNA分子要并排对齐，而且必须在同一个部位几乎同时产生断裂，以分别产生一个单链。这个要求太高，是一个“没有实验证据的猜想”，无法解释为什么会同时同地出现断裂。目前认为这个模型在解释异源双链的最初起源方面是不正确的，但是其中提出的“Holliday连接体”和“支链迁移”两个概念被保留了下来。 21 双链断裂模型(DSB)是如何解释同源重组发生过程的？(笑笑笔记本1) 同源重组的启动是由于双链断裂 双链断裂模型: 1. 两同源DNA分子之一发生双链断裂 2. 切口在外切酶作用下扩大为间隙,形成3’末端 3. 其中一个以单链入侵的方式侵入同源的DNA分子，与互补序列配对 4. 相对应的链被置换出来,与原来断裂的链配对 5. 经修复合成和链的再连接,形成两个Holliday连接体，沿异源双链分支迁移 6. Holliday中间体解离、重组 22 Holliday连接体的拆分有哪2种不同的方式？各自产生的后果有什么不同？ 答案参见第19题 23 比较Holliday 模型和双链断裂模型在解释同源重组发生的过程中有哪些不同？ Holliday模型： （1）2个DNA分子各有1条链在相同的位置被一种特异性的内切酶切开； （2）被切开的链交叉并与同源的链连接，形成χ（chi）状的Holliday连接。 双链断裂模型 （1）一个DNA分子的两条链均被切断，细胞中的一种II型DNA拓扑异构酶将被切断的DNA分子连接起来确保不会彼此完全脱离。 （2）每一端中有一条链被核酸外切酶修剪，结果末端形成有大约500bp左右的3’端突出结构。 24 进行同源重组至少要有多长的同源序列？ 进行同源重组至少需要75bp的同源序列；而southen杂交只要两个DNA有10个bp是互补的，即可形成链杂交。由此可见，同源重组不仅仅是碱基互补配对。 PS : 实验证明如果同源顺序短于75bp，则重组频率大降低。这个长度要比两条互补的单链形成双链所需的长度（约10bp）要长得多。 25 解释RecA, RecBCD, RuvA, RuvB, RuvC在同源重组中的功能。 RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链的主要途径，RecBCD酶具有三种酶活性： ①核酸外切酶活性， ②核酸内切酶活， ③解螺旋酶。 1. 当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并向前寻找特异的位点。 2. 寻找的位点是一个8碱基序列，被称为chi的位点 (5’-GCTGGTGG-3’)，然后在3’侧56个核苷酸处将链切，产生具有3’末端的游离单链。随后单链被RecA蛋白结合，参与重组以后各步骤。（大肠杆菌基因组共有1 000多个chi位点，分布在DNA各部位，平均6kb有一个。据认为同源重组的发动就是由RecBCD引起的） RecA是参与同源重组最重要的酶，它参与各种途径的重组系统。 ☆ RecA 有两个主要的功能 （1）诱发SOS反应—作为共蛋白酶促进LexA 蛋白和属于DNA聚合酶V的UmuD的自水解。 （2）促进DNA单链的同化，即促进DNA单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。 ◇ 当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝。（RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸） ◇ RecA蛋白分子质量为38 000，它与单链DNA结合形成螺旋纤丝。此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列，迅速寻找与单链互补的序列。 ◇ 互补序列一旦被找到，单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来。链的交换速度大约为6bp／s，交换沿单链5-3方向进行，直至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP提供反应所需能量。 ◇ 任何部位的单链DNA均可借助RecA与同源双链DNA进行链的交换。 RuvA RuvB RuvC的功能 ：由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。 1. RuvA蛋白：能够识别Holliday联结体的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB6(或8)聚体结合在双链DNA上，位于交叉点上游。 2. RuvB是—种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动。（RuvAB复合物的移动速度约为10-20bp／s。） 3. RuvC：同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。RuvC识别四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定结果是片段重组还是拼接重组。 同源重组小结： 同源重组在两个同源位点都能发生，包括减数分裂和DNA中双链断裂的修复。 解释同源重组的重组机制的模型有Holliday model、单链断裂模型和DSB model. 大肠杆菌中研究最为清楚的同源重组途径是RecBCD途径，参与蛋白有RecA,RuvAB和RuvC Holliday交叉的拆分决定了重组的产物是发生了链的交换还是修复损伤DNA。 26 解释什么是鼠沙门氏伤寒杆菌的相转变。 位点特异性重组：指不依赖于DNA序列的同源性，而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组 鼠沙门氏伤寒杆菌的相转变（细菌的位点特异性重组）：利用重组倒置控制基因表达。 1. 如果两个正向重复序列之间发生位点特异性重组，就导致中间的DNA缺失。 3. 如果两个反向重复序列之间发生位点特异性重组，就导致中间的DNA序列的倒位。 27 了解抗体基因之间是如何连接的？抗体多样性产生的原因是什么？ (一)抗体的产生（ DVJ重组） 决定轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类基因片段。 L代表前导片段，V代表可变片段，J代表连接片段，C代表恒定片段。 决定重链的基因族上共有L、V、D、J、C五类基因片段，其中D代表多样性片段。在J和C片段之间存在增强子。(重链基因除V片段、J片段外，还有10～30个D片段，并有多个恒定区(C片段)以决定抗体的效应功能，即抗体的类型和亚类型。) 除淋巴细胞外，所有细胞免疫球蛋白基因族的结构都是相同的，称为种系结构，只有骨髓干细胞在分化为成熟B淋巴细胞的过程中才出现免疫球蛋白基因的体细胞重排。 在B细胞分化过程中，首先出现免疫球蛋白基因位移，然后才进行重排。 重排具有严格的顺序，第一次重排发生在前B细胞中，最先由编码免疫球蛋白重链的基因族片段参与重排，使在种系中相互分离的片段经重排后连接在一起，称为V-D-J连接。 其间，D片段与J片段先连接，接着V片段加到D-J上，形成V-D-J复合体。 重链：D-J→V-D-J 重排中选择的片段是随机的，片段之间序列在重排中被删除。 重链重排后接着是轻链κ链基因重排，形成V-J复合体。只有κ链基因重排失败，才发动λ链基因重排，故抗体中大部分轻链是κ链，λ链只占少部分。淋巴细胞在繁殖过程中还发生体细胞突变，以增加抗体的多样性。 PS: ◇ 由于淋巴细胞是二倍体，因而H链、κ链和λ链都有两个等位基因族，然而重排表现 出等位基因排斥(allelic exclusion)，即两个等位基因中只发生一个等位基因重排。 二者之中何者重排是随机的，但只要一个等位基因发生重排，另一等位基因即受到抑 制，不再发生重排。 ◇ 轻链基因重排还表现出同型性排斥，即κ链和λ链基因只有一种轻链基因发生重排。 ◇ 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链基因的V-J重排均发生在特异位点上。 ◇ 在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(RSS)。该信号序列都由一个共同的回文7核苷酸(CACAGTG)和一个共同的富含A 9核苷酸(ACAAAAACC)，中间为固定长度的间隔序列，或为12bp，或为23bp。 间隔长度是一种识别信号，重组只发生在间隔为12 bp与间隔为23 bp的不同信号序列之间，称为12-23规则。 ◇ 重链基因V片段的信号序列间隔为23 bp，D片段两侧信号序列间隔为12bp，J片段信号序列的间隔为23 bp， ◇ 信号序列总是以7核苷酸一端与基因片段相连，12与23两信号序列的方向相反。因此，在V-D-J连接中不会发生连接错误。同样，在轻链基因中，V片段和J片段与不同信号序列相连，只能在它们之间发生连接。 (二) 抗体多样性产生的原因 免疫球蛋白的基因VDJ重组时的连接是一种不精确的连接，会导致连接处的碱基丢失或额外增加，可以增加产物抗体的多样性。 28 了解遗传重组在分子生物学中的应用。 n 基因工程小鼠:转基因小鼠、基因剔除小鼠和基因替换小鼠统称为“基因工程小鼠”。 基因工程小鼠为人们研究肿瘤的发生、发展及治疗提供了一个重要工具。在癌基因、抑癌基因的研究中取得了丰硕的成果，并为潜在致癌源的测试、抗癌治疗及抗癌药的筛选开拓了新途径。 n 转基因动物的应用还有： ①生产药用蛋白 ②建立人类疾病的转基因动物模型，如肝癌模型、老年痴呆症模型、高血压模型。 ③生产可用于人体器官移植的动物器官 ④提高家畜产量 n 近年来随着对某些疾病基因水平的研究进展，转基因技术应用范围日益扩大，主要应用于恶性肿瘤、遗传性疾病、烈性传染病等发病机制、治疗与预防研究。 n 所谓“打靶”就是对靶基因进行直接作用，主要指通过同源重组诱发突变或改建。 n 基因同源重组与DNA重组概念不同，DNA重组是通过人工酶解和连接组建新的DNA片段的过程。基因同源重组是基因转染方法，把人工组建的与靶基因同源的片段整合到受体细胞的基因组中使之与靶基因发生同源重组而整合在一起。 n 根据同源重组后靶基因的变化，将基因打靶分为两类： ①基因破坏或剔除 ②基因取代 n 基因打靶技术是新兴的分子生物学技术，具有定位性强、打靶后的基因随染色体DNA稳定遗传的特点，是一种理想的修饰和改造生物遗传物质的方法。 n 基因打靶技术的应用： ①改造生物，培育新的生物品种。 ②用于基因治疗。 ③在基础学科中的应用。如对胚胎干细胞进行打靶修饰，观察基因在发育中的作用