酶学与酶工程重点总结.docx

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1、精品名师归纳总结其次章酶学基础否为活力所必需。优点：学习必备欢迎下载（2） 亲核攻击集团： -OH,-SH,-N （咪唑基）（3） 底物亲电中心：可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结一、酶的活性中心active center, active site（一）活性中心和必需基团1、与酶活性显示有关的,具有结合和催化底物形成产物的空间区域, 叫酶的活性中心 ,又叫活性部位。2、活性中心可分为 结合部位 和催化部位 。3、结合部位 打算酶的 专一性 ,催化部位 打算酶所催化 反应的性质 。4、酶结构概述（1） 活性中心是一个三维实体。（2） 是有一些一级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组

2、成,有的仍包含辅酶或辅基的某一部分基团。（3） 在酶分子表面呈裂缝状。（4） 酶活性中心的催化位点和结合位点可以不止一个。（5） 酶活性中心的基团都是必需基团,但必需基团仍包括活性中心以外的基团。5、酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1. 接触残基 2帮助残基 3结构残基 4非奉献残基（二）酶活性中心中的化学基团的鉴别1. 非特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋白质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或仍原修饰反应,使基团结构和性质发生变化。假如某基团修饰后不引起酶活力的变化 ,就可初步认为此基团可能是非必需基团。反之,如修饰后 引起酶活力的降低或丢失 ,就此基团可能是酶的必需

3、基团。2. 亲和标记共价修饰剂 是底物的类似物,可专一性的引入酶的活性中心,并具有活泼的化学基团 如卤素 ,可与活性中心的基团形成稳固的共价键。因其作用机制是利用酶对底物类似物的亲和性而将酶共价标记的,故称为亲和标记。3. 差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮挡活性中心的情形下,加入共价修饰剂, 使后者只修饰活性中心以外的有关基团。然后去除底物或可逆抑制剂,暴露活性中心, 再用同位素标记的向一修饰剂作用于活性中心的同类基团。将酶水解后分别带有同位素的氯基酸,即可确定该氨基酸参加活性中心。4. 蛋白质工程这是讨论酶必需基闭和活性中心的最先进方法,即将酶蛋白相应的 互补 DNAcDNA 定点突变,此突

4、变的 cDNA 表达出只有一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白,再测定其活性,可以知道被置换的氨基酸是转变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基转变疏水残基,使其转变成亲水或另一疏水残基同时转变活性中心内外的几个氨基酸个或多个氨基酸的缺乏或插入转变酶蛋白的磷酸化位点或糖化位点不致引起立体障碍三 组成活性中心的重要化学基团丝氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸二、酶的结构和功能的关系（一）酶的一级结构与催化功能的关系酶的一级结构是酶的基本化学结构,是催化功能的基础。（二）酶的二级和三级结构与催化功能的关系酶的二级、三级结构是全部酶都必需具备的空间构型。维护酶的活性 部位所必

5、需的酶蛋白的二级和三级结构完全转变,就会使酶遭受破坏而丢失其催化功能,这是蛋白质变性的依据。1. 酶的变性和失活2. 活性中心的挠性3. 酶分子的结构域（三）酶的四级结构与催化功能的关系具有四级结构的酶,按其功能可分为两类,一类与催化作用有关,另一类与代谢调剂关系亲密。三、酶催化作用的基本理论（一）酶底物复合物1. 酶底物复合物存在的证据1903 年, Henri 用蔗糖水解酶水解蔗糖提出的。E+S= ES= P+ E（S：substrate, P: product）在反应过程中,酶第一与底物形成酶 -底物中间复合物（ ES, enzyme-substrate intermediate）s ,

6、再分解成酶（ E）和产物（ P）,使反应沿一个低活化能的途径进行,降低反应所需活化能。2. 酶与底物形成复合物的作用力1） ）离子键2） ）氢键3） ）范德华力（二）酶作用的专一性机制1. 锁钥学说（ lock and key theory）2. 诱导契合学说（ induced-fit hypothesis）（三）酶作用的高效性机制1. S 与 E 的靠近效应和定向效应 proximity and orientation靠近效应：指两个反应的分子,它们反应的基团需要相互靠近, 才能反应。2. 酸碱催化 acid or base catalysis酸碱催化是通过瞬时的向反应物供应质子或从反应物接

7、受质子以稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。 由于 E 活性中心含有酸碱基团 , 它们可以与 S中的酸碱基团进行质子交换, 加强了 E 与 S 的相互作用, 减弱了 S 分子内部的化学键,使 S 由稳态不稳态狭义酸碱催化（ specific acid-base catalysi）s： H和 OH广义酸碱催化（ general acid-base catalysis： 质子供体和质子受体3. 共价催化 covalent catalysis（1）共价催化又称亲核催化（ nucleophilic catalysis）或亲电子催化（ electrophilic catalysis）磷酰基（ P=O）酰

8、基（ C=O） 糖基（ Glu-C-OH）4. 金属离子催化 5多元催化 6微环境的影响注：活性中心可以防止水分子的干扰（在躲开水分子的干扰后,分子间的离子键才简洁产生）7. 底物的变形（ distortion）与张力作用（ tensility四、影响酶促反应速度的因素1. 底物浓度对酶反应速度的影响随着底物的增加,反应速率西先是符合一级反应,再到混合级反应, 最终当底物增加到肯定浓度是达到最大反应速度,此时为零级反应。2. 酶浓度的影响（ 1）底物充分时,反应速度随酶浓度的增加而增加,反应速度与酶浓度成正比（ 2）底物浓度不足时,起初反应速度与酶浓度成正比。（ 3）底物中有不行逆抑制物存在时

9、,反应速领先成正比,当酶浓度达到肯定是反应速率不会成正比（ 4）酶液中有可逆抑制剂存在时,反应速率最酶增加而增加,但是可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结学习必备欢迎下载不符合正比,并且最初的反应速率变化最小。3.温度的影响：随温度增加反应速领先增加后减小4. pH 的影响2） 同工酶和个体发育及组织分化亲密相关3） 同工酶与代谢调剂4） 同工酶与癌基因的表达随 pH 增加反应速领先增加后减小pH 影响的机理：1）pH 影响 E 活性中心及邻近有关基团的解离,使之易或不易与S5） 同工酶分析法在农业上已开头用于优势杂交组合的猜测6） 临床上可作为疾病的诊断指标。三、别构酶和修饰酶1

10、.别构酶 allesteric enzyme可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结结合。2） pH 影响 S 的极性基团,从而影响这些基团与E 的结合。3） 过酸、过碱可使酶变性失活。2）酶的抑制剂抑制作用与抑制剂（ inhibition and inhibitor ）：酶分子中的必需基团的性质受到某种化学物质的影响而转变, 导致酶活性的降低, 甚至丢失, 但并未引起酶变性的作用称 抑制作用 。可逆抑制 Reversible Inhibition通常以非共价键与酶和（或）酶 -底物复合物可逆性结合,使酶活性降低或消逝。 采纳透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去,使酶复原活性。类型：竞争

11、性抑制（ competitive inhibition ）非竞争抑制（ noncompetitive inhibition ）其次节酶在生物体内的几种存在方式一、单体酶、寡聚酶、多酶复合体1. 酶蛋白是一条具有三级结构的多肽链, 相对分子量为 13000-35000, 不能再解离成更小的组成单位2. 寡聚酶具有四级结构,是由两个或两个以上的亚基组成的酶,这些亚基可以是相同的,也可以是不同的3. 多酶复合体多酶复合体是指几个酶联合而成的络合物, 其中酶以非共价键彼此嵌合在一起。一般由 26 个功能相关的酶组成,这样更有利于生化反应的连续进行,以提高酶的催化效率,同时也便于机体对酶的调控。 1 ）

12、多酶复合体组成成分的结合强度可能差别很大2） ）在催化活性上没有直接相关的酶也可以组成多酶复合体3） ）在细胞内各种多酶复合物仍可能通过和细胞膜或细胞器结合在一起。从而通过相互邻近组成高效的物质和能量代谢系统。二、同工酶同工酶具有多种生物学功能：1） ）同工酶作为遗传标志已广泛被遗传学家用于遗传分析的讨论。概念：具有别构调剂作用的酶称作别构酶。很多寡聚酶具有调剂亚基,催化亚基只结合底物,调剂亚基结合调剂剂,因此称别构酶,是调剂代谢的重要酶。2.修饰酶1修饰酶的类型 2修饰酶的特点1 绝大多数修饰酶具有无活性有活性 或低活性高活性 两种形式2耗能少3效率高四、结构酶和诱导酶 五、胞内酶和胞外酶

13、第三节 酶活力测定一、酶活力单位酶活力（ enzyme activity, 也称酶活性）：酶催化反应的才能,酶活力用在肯定条件下,它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。酶的活力单位（ IU, active unit ）1 IU：指在最适反应条件下, 1 分钟内催化 1mol 底物转化为产物所需的酶量。酶的比活力（ specific activity）指每 mg 蛋白质所具有的酶活力,一般用U/mg 蛋白质来表示。二、酶活力的测定方法酶活力测定时条件的挑选：1. 挑选合适的化学反应及检测指标 2底物浓度的挑选3其他条件的挑选（ pH,温度,缓冲液,帮助因子或辅酶,激活剂,抑制剂）三、酶的纯度鉴

14、定酶产品质量评判 中常使用比活力。判定分别纯化方法的优劣,通常用两个指标来衡量： 总活力的回收：表示提纯过程中酶的缺失情形比活力的提高的倍数：表示提纯方法的有效性得率和纯化倍数的运算：总活力 =活力单位数 /mL 酶液 X 总体积（ mL ） 比活力 =总活力/ 总蛋白（ mg）可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结得率=每步骤的总活力 / 第一步的总活力以百分比表示,第一步的得率为 100%纯化倍数 =每步骤的比活力 /第一步的比活力起始的纯化倍数为 1第四节酶促反应动力学酶促反应动力学 Kinetics of enzyme-catalyzed reaction ：是讨论酶促反应的

15、速率以及影响此速率的各种因素的科学,是酶学的一个分支。2. 米氏常数的意义1）V = 1/2 Vmax, Km = S 。米氏常数的单位为mol/L 。Km 值的物理意义就是 Km 值是酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。2） Km 是酶的一个特点常数。3） 假如一个酶有几种底物,就对每一种底物都有一个Km,Km 值最小的为这个酶的最适底物。4） Km 受温度、pH、的影响,Km 值是常数是指对于肯定底物在肯定温度、 pH 条件下是一常数。5依据米氏公式可以人为的把握反应速度V6） 依据抑制剂对 Vmax 、Km 的影响,可推断抑制剂的类型7） ）催化可逆反应的酶,对正逆反应的底物的K

16、m 往往是不同的,8 有助于查找代谢过程的限速步骤。9 ）明白酶的 Km 值及在细胞内底物的浓度,可推知该酶在细胞内是否受究竟物浓度的调剂。2. 稳态前在任何一个酶反应系统中,酶和底物一经混合,就会立刻生成酶底物络合物 ES及产物 P,并随时间而逐步上升。 但经过肯定时间后, ES 的形成与分解达到动态平稳,而 P 也将以恒定速度生成,系统进人稳态。 但是在进入稳态前的动力学与稳态时的动力学关系不同,不能用米氏方程表示。3. 反应全过程和逆反应4. 高底物浓度抑制与活化5. 多底物反应6. 高酶浓度三、可逆抑制动力学可逆抑制剂：最典型的例子为磺胺类药物。第三章、酶的生物合成（ enzyme p

17、roduction）第一节、微生物发酵产酶微生物发酵产酶的优点：1）微生物种类繁多。2) 微生物生长周期短,繁育快,培育便利。3) 微生物易改造,可通过多种手段育种。4) 一种微生物可以产生多种酶。一、产酶微生物的种类用于酶的生产的细胞必需具备几个条件(1) 酶的产量高(2) 简洁培育和治理(3) 产酶稳固性好,不易变异退化,不易被感染(4) 利于酶的分别纯化 最好是产胞外酶 分别纯化步骤越少越好,在生产中不同物质占有不同比例(5) 安全牢靠,无毒性(6) 如菌体退化,就调剂生产条件,复原原先处理（一）细菌（ 1 无芽孢杆菌 2 芽孢杆菌 3 球菌（二）放线菌（actinomycetes（三）

18、酵母菌：酿酒酵母、球拟酵母、假丝酵母（四）霉菌：黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉二、产酶菌的来源1. 土壤中的产酶微生物2. 水体中的产酶微生物3. 空气中的产酶微生物4. 极端环境中的产酶微生物三、产酶微生物的分别与挑选可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结菌种除了可以分别挑选得到,仍可通过向菌保中心购买, 四、发酵工艺条件及其掌握微生物进行发酵生产成为当今酶生产的主要方法。依据细胞培育方式的不同,酶的发酵生产可以分为固体培育发酵、液体深层发酵、固定化细胞或固定化原生质体发酵等。液体深层发酵：现在应用的主要方法固定化细胞或固定化原生质体发酵：将细胞固定在水不溶性的物质载体上,

19、细胞是固定不动的可以进行连续生产酶的发酵生产是以获得大量所需酶为目的的。为此,除了挑选性能良好的产酶细胞以外,仍必需满意细胞生长、繁衍和发酵产酶的各种工艺条件,并依据发酵过程的变化进行优化掌握。1. 细胞活化性能优良的产酶细胞选育出来以后,必需尽可能的保持其生长和产酶特性不变异,不死亡,不被杂菌污染等。保藏细胞在使用之前必需接种于新奇的斜面培育基上,在肯定的条件下进行培育,以复原细胞的生命活动才能,这就叫做细胞活化。2. 培育基培育基是人工配制的用于细胞培育和发酵的各种养分物质的混合物。培育基多种多样,千差万别,但培育基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等几个方面。培育基的设计原就：a

20、 相宜的养分物质b 养分物质的浓度与配比合适c 物理、化学条件合适d 经济节省e 细心设计,试验比较1）培育基的组分a 碳源凡能供应细胞养分所需的碳元素碳架的养分源,称为碳源 carbon source。细胞中碳元素含量相当高, 一般占干物质的 50左右, 因此碳源是工业发酵中使用的主要原料之一。挑选碳源应当考虑：原料的供应和价格,最常用的碳原为淀粉水解物b 氮源凡能供应细胞生长繁衍所需氮元素的养分源,称为氮源。氮源主要功能是构成细胞的蛋白质、核酸以及含氮代谢产物。同时,当培育基中碳源不足时,可作为补充碳源。氮源可分为有机氮源和无机氮源两种。有机氮源、无机氮源培育基中碳和氮两者的比例对酶的产量

21、有显著的影响。C/N c 无机盐和微量元素无机盐的主要作用是供应细胞生命活动不行缺少的无机元素,并对培育基的 pH、氧化仍原电位和渗透压起调剂作用。各种无机元素的功用各不相同,是细胞的主要组分,是酶的激活剂或抑制剂。对培育基的 pH、渗透压、氧化仍原电位起调剂作用。大量元素和微量元素d 生长因子生长因子 growth factor是一类对细胞正常代谢必不行少且不能用简洁的碳源和氮源自行合成的有机物。它的需要量一般很少。广义的生长因子除了维生素外,仍包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、以及动植物生长的激素等。e 水：水是微生物最基本的成分（ 70%-90%） 水是微生物吸取养分物质、排泄代谢物的溶剂水细

22、胞成分,直接参加代谢活动调剂细胞环境的温度稳固 2）发酵培育基：试验中常用的培育基制工业发酵培育基时的一般要求为：养分物质的组成较丰富在肯定条件下,所实行的各种原材料彼此之间不能产生化学反应, 理化性质相对稳固黏度适中,具有适当的渗透压原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成中的调剂关系生产过程中的问题质优价廉,成本低。3. pH 的影响及其掌握(1) pH 对发酵的影响pH 对微生物代谢活性产生影响的主要缘由有以下几方面：细胞内的 H或 OH-离子能够影响酶蛋白的解离度和电荷情形 pH 影响细胞对基质的利用速度和细胞的结构 pH 影响细胞膜的电荷状况(2) 影响 pH 变化的因素发酵过程中培育基

23、 pH 的变化由菌种的特性,培育基组成,发酵条件等打算,引起 pH 变化的主要缘由：生理酸性盐生理碱性盐(3) 发酵 pH 的确定和掌握1) 发酵 pH 的确定2) pH 的掌握第一需要考虑和试验发酵培育基的基础配方：其次可在发酵过程中直接补加酸或碱和补料的方式来掌握溶解氧调剂,掌握代谢中间产物的氧化程度 4温度对发酵的影响(1) 发酵温度的影响温度的变化对发酵过程可产生两方面的影响：一方面是影响各种催化酶反应的速率和蛋白质的性质。 另一方而是影响发酵液的物理性质(2) 影响发酵温度变化的因素在发酵过程中温度的变化主要是由于发酵过程中既存在产生热能的因素,又存在散失热能的因素。(3) 最适温度

24、的挑选与掌握温度掌握一般采纳热水升温、冷水降温的方法,故此在发酵罐中,均设计有足够传热面积的热交换装置,如排管、蛇管、夹套、喷淋管等, 以保证能较好的掌握发酵过程中的温度。5溶氧的影响及其掌握(1) 溶氧的影响细胞的生长繁衍以及酶的生物合成过程需要大量的能量,这些能量一般是由 ATP 等高能化合物来供应。为了获得足够的能量,以满意细胞生长和发酵产酶的需要,培育基中的能源一般由碳源供应。碳源必 须经过有氧分解才能合成大量的ATP。(2) 溶氧浓度的掌握发酵液的溶氧浓度变化,是由供氧和需氧两方面所打算的。掌握发酵液中的溶氧浓度,需从如下两方面着手：1) 从供氧方面考虑提高氧分压。增加通气量。延长气

25、液接触时间。增加气液比表面积。转变培育液的性质。添加氧载体。2) 从需氧方面考虑依据需氧,可采纳以下两方面的手段来提高发酵液中的溶氧速率：限制培育液中的养分成分,削减细胞生长速率。降低培育温度：五、提高酶产量的措施除了具有高产的菌种及合理的发酵工艺外, 仍可通过一些其它的措施如添加诱导物。掌握阻遏物浓度、添加表面活性剂等提高酶的产量。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结1. 添加诱导物2. 掌握阻遏物的浓度3. 添加表面活性剂4. 添加产酶促进剂一、酶生物合成的模式学习必备欢迎下载可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结其次节、酶的发酵动力学发酵动力学主要讨论在发酵过程中细

26、胞生长速度、产物生成速度、基质消耗速度以及环境因子对这些速度的影响。 在酶的发酵生产过程中,讨论细胞生长和发酵产酶动力学,对于明白酶生物合成模式、发 酵条件的优化机制、提高酶产量,均有相当重要的意义。微生物的生长过程可以用细胞浓度的变化来表示。以细胞浓度的对数与细胞培育时间作图,可知,在分批培育中,细胞生长一般经受 调整期,指数生长期,平稳期,衰亡期。比较酶产生与细胞生长的关系 ,可把酶生物合成模式分成 4 种类型:可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结第三节：动植物细胞产酶利用动植物细胞培育生产各种自然物质,是生物工程的一个新 领域,

27、20 世纪 80 岁月以来,利用植物细胞培育生产的有用产物已达 100 多种,其中酶制剂有 10 多种。包括糖苷酶 胡萝卜细胞, 1981,过氧化物酶 甜菜细胞, 1983。大豆细胞, 1989等。出现出良好的进展前景。一、动植物细胞的特点： 1、体积比微生物大。 2、对剪切力敏锐。 3、生长和代谢速率低,生长倍增时间和发酵周期长。4、动物细胞养分要求复杂。 5、发酵产物不同二、植物细胞培育与发酵1、植物细胞发酵技术和特点：发酵特点（与直接提取分别相比较而 言）：（1）提高产率。（2）缩短周期 ;（3）易于治理、减轻劳动强度。（4）提高质量。2、植物细胞发酵技术(I) 高产细胞系的挑选： 主要

28、有以下几个途径：材料挑选,克隆挑选, 抗性挑选,诱变挑选 ,细胞工程和基因工程挑选。(II) 影响产物产量的因素：材料来源 ,培育基成分, 光照和温度, pH, 细胞形状分化程度等 ;(III) 提高产物产量的途径： 挑选高产细胞系, 掌握细胞生长和分化程度,加入诱导物或前体,两相培育和产物释放,毛壮根培育技术。(IV) 植物细胞培育系统专用的生物反应器。2、植物细胞发酵产酶的工艺条件掌握（1） 植物细胞生长和发酵所使用的培育基：大量无机盐、维生素和植物激素、无机氮源、碳源（蔗糖）MS 培育基和 B5 培育基（2） 温度和 pH 值（ 3）通风与搅拌（ 4）光照的掌握（5）前体的添加（ 6）刺

29、激剂的应用三、动物细胞发酵1、动物细胞可以生产多种具有较高价值的药物,特殊是疫苗、激素、单克隆抗体和酶等。由动物细胞培育生产的酶有胶原酶,血纤蛋白溶酶原活性剂等。2、动物细胞培育方法： 悬浮培育。固定化细胞培育3、动物细胞发酵工艺条件的掌握第四节、固定化细胞发酵产酶固定化细胞：又称固定化活细胞、 固定化增殖细胞用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁衍和新陈代谢的细胞。是70 岁月后期 1978 进展起来的技术 ;在发酵生产淀粉酶、 蛋白酶、纤维素酶等胞外酶方面取得了胜利。一、固定化细胞发酵产酶的特点1、提高产酶率：细胞密度增大生化反应加速产酶率提高2、可在高稀释度下连续发酵： D 不影响固定化

30、细胞 ;3、基因工程菌的质粒稳固,不易丢失。 4、发酵稳固性好：细胞受载体爱护, pH 和 T 适应性宽。 5、缩短发酵周期,提高设备利用率。 6、产品简洁分别纯化。 7、适于胞外酶等胞外产物的生产。二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件掌握与游离细胞发酵大同小异,需特殊留意的几个问题：1、固定化细胞的预培育先预培育,使固定在载体上的细胞生长繁衍,长好后,再用于发酵产酶,其培育基和工艺条件可以相同或不同。2、溶解氧的供应由于受到载体的影响,使氧的供应成为主要的限制性因素。解决方法：（1）加大通气量（剧烈搅拌会破坏固定化细胞） 。（ 2）转变固定化载体,如少用琼脂等对氧扩散不利的载体。（ 3）过氧化氢

31、酶与细胞共固定化,培育基加入适量的H2O2。（ 4）降低培育基的浓度,以降低培育基的粘度。3、温度的掌握： 连续发酵时, 由于 D 较高,反应器内温度变化较大, 先预调流加液温度。4、培育基成份的掌握某些固定化载体的结构会受到某些成份的影响, 如过量的磷酸盐会破坏海澡酸钙凝胶制备的固定化细胞。第五节、固定化微生物原生质体发酵产酶原生质体是除去细胞壁后由细胞膜及胞内物质组成的微球体。由于原生质体不稳固,通过凝胶包埋法可使之稳固性提高。 可使原先胞内产物分泌到细胞外。一、固定化原生质体的特点1、变胞内产物为胞外产物。 2、提高产酶率。 3、稳固性较好。 4、易于分别纯化。二、固定化原生质体发酵产酶的工艺条件及其掌握（ 1）渗透压的掌握。（2）防止细胞壁的再生。 （3）保证原生质体的浓度。可编辑资料 - - - 欢迎下载