chapter-04-表达载体.ppt

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1、1、 大肠杆菌表达载体的结构大肠杆菌表达载体的结构序列特异性序列特异性方向性方向性位置特性位置特性种属特异性种属特异性（1）常见原核强启动子）常见原核强启动子（2 2）原核表达载体类型）原核表达载体类型1 1）融合型表达载体）融合型表达载体 P PSDSDForeign DNAForeign DNA融合型表达载体融合型表达载体融合基因融合基因克隆基因插入原核基因序列克隆基因插入原核基因序列33端而维持正确阅读框架。端而维持正确阅读框架。技术关键技术关键-ATG - AAC CTG GAA TTC CTA GGT -TAC -TTG GAC CTT AAG GAT CCA-EcoRIBamHIA

2、AT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列载体部分序列DNADNA序列序列融合蛋白融合蛋白融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。称为融合蛋白。表达效率高表达效率高产物稳定产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定定易纯化：利用融合原核多肽的特性易纯化：利用融合原核多肽的特性融合蛋白表达的特点

3、或优点融合蛋白表达的特点或优点: :TacTac：IPTGIPTG诱导诱导GSTGST融合蛋白融合蛋白直接纯化直接纯化产物切割方便：产物切割方便： pGEX-1pGEX-1 TT凝血酶凝血酶 pGEX-2T-pGEX-2T-凝血酶凝血酶 pGEX-3T-XpGEX-3T-X因子因子位相载体位相载体融合型载体融合型载体-pGEX-pGEX系列系列位相载体位相载体-含有含有3 3种读码框的系列载体种读码框的系列载体P PSDSDForeign DNAForeign DNA非融合型表达载体非融合型表达载体非融合基因非融合基因主要元件：强启动子；主要元件：强启动子；SDSD；ATGATG：第一个密码子

4、：第一个密码子2 2）非融合型表达载体）非融合型表达载体 PL启动子启动子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI非融合型表达载体非融合型表达载体-pPL-Lamda1 1、主要元件：、主要元件：启动子和启动子和SDSD序列序列信号肽序列信号肽序列 ：SDSD下游，编码信号肽，可下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜引导蛋白跨膜2 2、优点：分泌表达，避免降解。、优点：分泌表达，避免降解。 3 3）分泌型表达载体）分泌型表达载体 分泌型表达载体分泌型表达载体-pINIII-ompA1-pINIII-ompA1温度诱导表达载体温度诱导表达载体RPSDencoding gene TTtetrOriT

5、TGACA(17)TATAAAT-35 -10mRNA 5 UAAGGAGG(N)816S rRNA 3 AUUC CUCCATGUAAUGAUAGRBS第三节第三节 真核生物表达载体真核生物表达载体 Eukaryotic expression vectors一、酵母表达载体一、酵母表达载体Yeast expression vectors3.6kb分泌型表达载体具有AOX1启动子Zeocin抗性标记基因AOX1下游有多克隆位点多克隆位点下游有AOX1 3终止序列；含有强分泌信号肽：-factor二、哺乳动物细胞表达载体二、哺乳动物细胞表达载体Mammalian cell expression

6、vectorsMammalian cell expression vectors复制子复制子一般采用一般采用病毒基因组病毒基因组的复制子，带有这些复制子的表达载体的复制子，带有这些复制子的表达载体能以能以附加体附加体的形式进行复制。的形式进行复制。常见的复制子有常见的复制子有SV40SV40、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒、多瘤病毒和牛乳头瘤病毒等的复制子。等的复制子。不同表达复制子的效率是不相同的。不同表达复制子的效率是不相同的。启动子和增强子启动子和增强子长为长为100100200bp200bp，位于转录起始位点上游，一般由，位于转录起始位点上游，一般由核心核心启动子启动子和和上游启动子上游启动子

7、两部分组成。两部分组成。目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源目前构建的哺乳动物基因表达载体的启动子，主要来源于病毒，如于病毒，如SV40SV40早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子早期和晚期转录启动子、腺病毒晚期启动子等。等。病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅病毒载体的增强子位于转录起始位点的上游，它可大幅度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。度提高启动子的转录水平。多数增强子具有宿主特异性。终止信号和加终止信号和加poly(A)poly(A)信号信号RNARNA聚合酶的转录终止和加聚合酶的转录终止和加poly(A)poly(A)信号依赖于信号依赖于DN

8、ADNA模板模板上两种特异的序列，上两种特异的序列，一是位于一是位于poly(A)poly(A)位点位点上游上游11113030个核苷酸的一段高度个核苷酸的一段高度保守的六核苷酸序列保守的六核苷酸序列AAUAAAAAUAAA；二是；二是poly(A)poly(A)位点位点下游下游的的GUGU丰丰富区或富区或U U丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这丰富区。因此，在构建表达载体的时候必须加上这两种序列。两种序列。常用的加常用的加poly(A)poly(A)信号来自信号来自SV40SV40，它是一段长为，它是一段长为237bp237bp的的BamHBamH I I-Bcl I-Bcl I限

9、制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期限制酶酶切片段，它同时含有早期转录和晚期转录单位的切割信号与加转录单位的切割信号与加poly(A)poly(A)信号。信号。剪接信号剪接信号mRNAmRNA剪接所必需的最短序列位于内含子剪接所必需的最短序列位于内含子5 5 和和3 3 边界上。边界上。在构建真核表达载体时都组入一个在构建真核表达载体时都组入一个SV40SV40的内含子的内含子，利用该内含，利用该内含子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载子及其剪接信号构建的载体，表达外源基因的水平比普通的载体要高。体要高。选择标记基因选择标记基因为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建

10、表为了快速有效地筛选哺乳动物转化细胞，必须在构建表达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的达载体时组入动物细胞特异性选择标记基因。目前已发展的哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：哺乳动物细胞基因转化筛选标记如下表所示：GT-AG法则CHO-K1CHO-K1细胞细胞CHO-K1CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfrdhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择

11、压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml10g/ml以上。以上。在没有选择压力下，外源基因能稳定保持；在没有选择压力下，外源基因能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。该细胞株是目前应用该细胞株是目前应用最广泛最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活

12、剂（之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPAtPA）、）、干扰素干扰素、干扰素、干扰素 、凝血因子、凝血因子等在等在CHOCHO细胞中得到表达。细胞中得到表达。CHO-K1细胞特点它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达它来源于非洲绿猴肾细胞系，能组成性表达SV40SV40的大的大T T抗原。抗原。COSCOS细胞的特点细胞的特点： 细胞来源丰富；细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有能使转染到该细胞中的带有SV40SV40复制子复制子的转录载体快速扩增；的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。能瞬时大量表达外源基因的产物。由于转染

13、质粒在由于转染质粒在COSCOS细胞中无节制复制，最终将导致细胞细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用无法忍受而死亡。利用COSCOS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。能分析等研究。COSCOS细胞细胞鼠骨髓瘤细胞如鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0Sp2/0、NSONSO和和J558LJ558L等已被用作基因表等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（IgIg）、）、tPAtPA等多种外等多种外源基因在鼠

14、骨髓瘤细胞中得到表达。源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。鼠骨髓瘤细胞的特点：鼠骨髓瘤细胞的特点：细胞易于培养和转染，可在无血清培细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养；养基中进行高密度悬浮培养；能进行分泌表达，且表达量高；能进行分泌表达，且表达量高；能对蛋白质进行糖基化修饰。能对蛋白质进行糖基化修饰。鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞（1 1）设法提高外源基因的表达水平和产量）设法提高外源基因的表达水平和产量：（2 2）改造宿主细胞的特性）改造宿主细胞的特性（3 3）抑制细胞凋亡，延长细胞周期）抑制细胞凋亡，延长细胞周期：（4 4）提高表达蛋白糖基化水平）提高表达蛋白糖基化水平：通过通过

15、DNA同源重组，使细胞特定的同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失内源基因被破坏而造成其功能丧失或在基因组特定的位点插入外源基或在基因组特定的位点插入外源基因。因。1. 基因打靶（基因打靶（gene targeting）基因敲出（基因敲出（knock-out）基因敲入（基因敲入（knock-in）第四节第四节 基因打靶载体（基因打靶载体（Targeting vector）1. 1. 要求能整合到染色体上特定的位置。要求能整合到染色体上特定的位置。2. 2. 整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物整合的位置尽量选在基因组内编码非必需产物的地方。的地方。3. 3. 必须整合在基因组

16、中可以转录的区域。必须整合在基因组中可以转录的区域。定点整合定点整合1. 两段同源两段同源DNA序列（序列（HB1和和HB2）2. 目的基因目的基因3. 编码抗编码抗G418的基因（的基因（neor）4. 胸苷激酶基因（胸苷激酶基因（HSV-tk1和和HSV-tk2）与靶位点两端的区域同源与靶位点两端的区域同源新霉素（新霉素（neomycin）磷酸转移酶基因）磷酸转移酶基因分别来自分别来自I型和型和II型单纯疱疹病毒（型单纯疱疹病毒（HSV）。）。载体载体tk1 HB1neor目的基因目的基因HB2tk2载体载体染色体染色体DNAHB1 染色体染色体DNAHB2 染色体染色体DNA载体载体tk

17、1HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体染色体染色体 tk1HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2染色体染色体两个两个tk基因基因至少有一个至少有一个可能整合到基因组里。可能整合到基因组里。细胞被细胞被tk基因杀死基因杀死。1. 非特异整合非特异整合非同源重组非同源重组载体载体tk1HB1 neor目的基因目的基因HB2 tk2载体载体HB1 neor目的基因目的基因HB2染色体染色体DNAHB1 染色体染色体DNAHB2 染色体染色体DNA染色体染色体DNA染色体染色体DNA只有目的基因和只有目的基因和neor基因整合进去，基因整合进去，tk基因不会整基因不会整合。合。细胞在细胞在G418中存活中存活。正正-负选择法：负选择法：1. 正选择（正选择（positive selection）：）：用用G418进行选择。进行选择。没有整合进没有整合进neor基因的细胞都被杀死。基因的细胞都被杀死。2. 负选择（负选择（negative selection）：）：用用9-鸟嘌呤鸟嘌呤（ganciclovir，GCV）。）。表达胸苷激酶（表达胸苷激酶（tk）的细胞都被杀死（）的细胞都被杀死（Tk能把能把GCV转化成有毒的化合物转化成有毒的化合物）。）。