2022年环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制可研专业技术方案.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 环介导等温扩增快速检测病原菌新型试剂盒研制 可行性讨论报告李思光 南昌高校一、选题的必要性 1、工程所处技术领域产业政策 本工程属生物高技术领域,是国家重点支持的讨论领域,工程 主要针对严峻影响人类健康的主要病原菌的检测与诊断需要进行检 测技术的讨论与试剂盒的开发,本工程的实施可产生具有自主学问 产权的科研成果；本工程技术含量高,市场竞争力强,工程完成后 能够产生较好的经济效益和社会效益,工程符合国家产业、技术政 策；2、工程所处技术领域技术进呈现状 目前的病原菌检测方法费时、费劲、精确性低,开发快速、准 确、低成本的检测技术和配套试剂是病原菌

2、检测工作中亟待攻克的 难题；本工程针对病原菌检测中存在的问题,采纳高灵敏度、高特 异性的环介导等温扩增技术开发出简便、快速、经济的检测试剂；3、工程技术先进性,对相关领域技术进步的推动作用环介导等温扩增是利用4 个特别设计的引物和具有链置换活性名师归纳总结 的 DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技第 1 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 术；该技术在 1h 内能扩增出 10 9靶序列拷贝； LAMP技术以其特异性 强、灵敏度高、快速、精确和操作简便等优点在核酸的科学讨论、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益

3、广泛的应用；该技 术的推广对生物学、食品科学及医学领域中的检测和诊断技术的进 步有推动作用；4、工程目前进展情形 课题组开展了大量前期讨论工作,已完成了本工程所需的科研 平台建设任务,开展了嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温 扩增讨论,取得了阶段性讨论成果,这些工作为本工程的顺当完成 奠定了基础；二、技术方案论述（一）工程技术关键点和创新点,工程完成时达到的技 术水平 1、技术关键（1）本工程的技术关键之一是引物设计；与常规 PCR引物不 同,环介导等温扩增引物设计难度大,一组引物要求有 6 个位点与 靶序列完全匹配才能够进行扩增；目前我们已从国际基因组数据库中下载了部分病原菌的基因组DN

4、A,并依据基因组特点采纳等温扩增软件设计了部分引物,现正通过试验确定这些引物的性能；（2）本工程的另一技术关键是正确等温扩增体系优化；通过名师归纳总结 对引物浓度、内引物和外引物的正确浓度比、模板浓度、dNTP 浓第 2 页,共 12 页度、 BstDNA 聚合酶用量、 Mg 2+浓度等条件进行优化,能够获得正确- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 试验条件；2、创新点（1）既往对病原菌的检测一般采纳细菌分别培育鉴定法,但该 方法的精确率低,所需时间长,往往延误临床正确的诊断和治疗；近年来,人们将 PCR技术用于病原菌的检测；PCR技术虽然较传统 PCR

5、方法灵敏、快速,但需要较昂贵的仪器设备；更为重要的是,方法简洁产生非特异性扩增产物,造成假阳性和假阴性结果,影响 对样品的正确判定；本工程将建立适合于食品和临床标本大规模检 测的环介导等温扩增快速检测病原菌技术；与目前的检测方法相 比,等温扩增法具有快速、精确、灵敏的特点；而且,等温扩增法 是在恒温下进行,只需一个简洁的恒温装置,不需要 PCR试验中的 昂贵仪器,因而易于在基层食品质量检测部门和医院推广使用；（2）目前,国外已有将环介导等温扩增技术应用于病毒 DNA 和 RNA检测的报道,但将其应用于病原菌检测的文献报道极少,国 内基本上仍未开展环介导的等温扩增讨论工作；本工程首次提出将 环介

6、导的等温扩增技术应用于食品和临床标本中病原菌的检测,并 对目前的等温扩增方法提出改进策略,进展可同时检测多种病原菌 的多重等温扩增技术,以克服当前一个等温扩增反应只能检测一种 DNA或 RNA的缺点；因此,本工程的实施,将开发出具有自主学问 产权的病原菌检测试剂盒；3、工程完成时达到的技术水平 工程完成时,开发的多重环介导等温扩增快速检测病原菌技术名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 及其配套试剂盒达到国际先进水平；（二）工程技术方案1、技术方案（1）环介导等温扩增（病原菌方法的建立LAMP）和多重等温扩增快速检测常见

7、常见病原菌特异性 LAMP引物的设计；依据 GenBank数据库公布的常见病原菌 DNA序列,采纳 LAMP专用引物设计软件设计特异性 LAMP引物（包括每类致病菌的两个外引物、两个内引物和两个环引物,其中每个内引物均具有两段能够识别靶分子上特定位点的序列,以保证靶序列的特异性扩增；）常见病原菌基因组DNA的提取；采纳本试验室建立的基因组DNA快速提取技术提取致病菌 DNA；LAMP扩增反应体系的优化：对引物浓度、内引物和外引物的正确浓度比、模板浓度、等条件进行优化；dNTP 浓度、 BstDNA 聚合酶用量、 Mg 2+浓度温育条件的优化：在 55-65之间优化等温扩增温度；扩增产物的检测：

8、建立快速显色法和电泳分析法两种检测扩 增产物的方法；以上述讨论结果为基础,建立常见病原菌的环介导等温扩增 和多重环介导等温扩增快速检测技术；（2）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的灵敏度分 析名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 将常见病原菌目标基因克隆至pMD-18T 载体,转化后提取质粒,倍比稀释成含目的基因拷贝数为105、10 4、10 3、10 2、10 1,以其为模板做环介导等温扩增反应,检测本方法的灵敏度；（3）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法的特异性分析分别以病原菌和非病原菌基因组 反应,检测

9、本方法的特异性；DNA为模板做环介导等温扩增（4）常见病原菌的环介导等温扩增快速检测方法与国际标准 方法及常规 PCR扩增方法比较分析以 LAMP的两个外引物做常规PCR扩增,并与 LAMP的扩增结果进行比较分析,进一步判定 LAMP技术的灵敏度、特异性和稳固性；（5）常见病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测 方法在食品检测和临床诊断中的应用讨论 将本方法应用于食品检测和临床诊断中,分析本方法对不 同样品检测的精确率；（6）病原菌的环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测试剂 盒的研制依据本工程所建立的LAMP正确反应体系和LAMP反应产物显示方法,研制开发快速检测病原菌的试剂盒（包括单一

10、病原菌检测试 剂盒和多种病原菌同时检测试剂盒）；名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2、工艺流程样品收集 基因序列分析核酸提取 引物设计引物优化、组合LAMP 反应体系的建立反应条件优化特异性试验灵敏度试验阳性对比阴性对比LAMP方法应用于病原体检测国标法比较试验 同类产品比较试验试剂盒中试（三）工程技术质量指标（1）本工程建立的方法对病原菌检测的精确率达到 95%；（2）本工程建立的方法对病原菌目的基因检测的灵敏度达到名师归纳总结 10 1拷贝；第 6 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - -

11、 - - - - - - - （3）本工程建立的方法不产生非特异性扩增产物；（4）对病原菌目的基因的等温扩增过程在30-60 分钟内完成,显色法检测扩增产物在5 分钟内完成,电泳法检测扩增产物在60 分钟内完成；（四）工程执行过程中各阶段目标 2007 年度 第一季度：设计引物,引物合成,购买试验菌株和有关试剂,完善试验条件；其次季度：样品采集,病原菌 DNA提取；第三季度：等温扩增反应体系优化,温育条件优化；第四季度：扩增反应产物检测方法的建立（快速显色法、电泳 分析法）；2022 年度 第一季度：环介导等温扩增快速检测病原菌方法操作程序确 定,多重等温扩增同时检测多种病原菌试验技术建 立；

12、其次季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法的精确度分析；第三季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法的灵敏度分析；第四季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法与常规 PCR扩增方法比较分析；名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2022 年度 第一季度：环介导等温扩增和多重等温扩增快速检测病原菌方 法在食品和临床标本上的应用及成效分析；其次季度：环介导等温扩增快速检测病原菌试剂盒和多重等温 扩增试剂盒研制；第三季度：试剂盒的应用及技术推广；第四季度：课题总结,鉴定；（五）工程

13、经费预算情形 本工程申请科研经费 5 万元；其中设备、仪器购置费 1 万元；材料、样品加工费 0.5 万元；土建安装费 0.5 万元；资料、调研费0.5 万元；试验、检测费2 万元；鉴定费 0.5 万元；三、工程实施支撑条件 1、工程技术来源 本工程的技术由工程申请人建立；2、工程试验、检测条件 工程申请人所在学院生命科学学院拥有食品科学国家重点建 设学科、生物化学与分子生物学省级重点学科和食品科学训练部重 点试验室；这些重点学科和重点试验室设施完善、先进,具有进行 本工程讨论的试验条件和试验场地,为本工程的完成供应了保证；工程申请人所在的江西省生物化学与分子生物学重点试验室实名师归纳总结 验

14、条件先进,具有PE-9700 型 PCR仪,全自动DNA测序仪（ ABI 第 8 页,共 12 页Prism 3100型）、高速冷冻离心机、超速冷冻离心机、超低温冰- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 箱、 Milli-Q 超纯水系统、各种规格的电泳仪、紫外分光光度计、设施先进的细菌培育室等仪器设备；现已完成了本工程所需的科研 平台建设工作；工程申请人长期从事分子生物学讨论工作,娴熟把握了分子生 物学讨论技术；课题组已开展了本工程的前期讨论工作,目前正在 进行嗜水单胞菌和金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增讨论,基本掌 握了等温扩增专用引物设计软件的使用和等温扩

15、增的操作要点,这 为本工程的顺当完成奠定了技术基础；3、工程申请单位人才资源情形 工程申请单位南昌高校是我省唯独一所省部共建的“211” 工 程重点建设高校,人才资源丰富,科研力气雄厚；生命科学学院有专任老师 150 人,其中正副教授 员比例 2:1 ；60 人,讲师 28 人,中高级技术人4、工程组人员专业结构、职称结构工程组科研人员7 人,主要由生物化学与分子生物学专业、微生物学专业人员组成,专业结构合理；科研人员中,教授 2 人、副教授 2 人、讨论生 3 人；其中具有博士学位的老师 2 人；5、工程新增投资筹集情形本工程申请科研经费 5 万元；四、工程预期经济效益1、预期市场需求病原菌

16、的检测是食品检测和临床诊断中的常规工程,食品检测名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 部门和医疗机构对检测试剂的需求量庞大；等温扩增技术在病原菌的检测工作中有很大潜力；然而,目前国外仅有将其用于病毒 DNA和 RNA检测的讨论报道,在病原菌检测领域尚无以此技术开发的商业试剂,国内也未见这方面的讨论开发报道；因此,开发病原菌的环介导的等温扩增试剂具有宽阔的前景；2、预期盈利水平目前以传统方法检测一个样品中的一种致病菌的收费约 50元；本工程建立的检测技术检测一个样品的试剂成本约 8 元,假如以 20 元销售,可获利润12

17、 元；一个小型试剂生产企业一年至少可生产检测 50 万个样品的试剂,每年获利 600 万元；因此,该技术的 推广可产生明显的经济效益；3、预期产业化前景 本工程是针对严峻影响人类健康的病原菌的检测问题提出的,讨论成果的有用性强,易于转化；在产品的研制工作中采纳了现代 分子生物学新技术,产品的科技含量高,生产成本低,利润空间 大；本产品的生产不需特别大型设备,产品定型后可向中小型生化 试剂生产企业转让,因此,本工程的产业化前景宽阔；我省具有一 定生产才能的试剂生产企业经技术培训后可生产本产品；4、工程实施风险分析 课题组已开展了本工程的前期讨论工作,目前正在进行嗜水单 胞菌和金黄色葡萄球菌的环介

18、导等温扩增讨论,基本把握了等温扩 增专用引物设计软件的使用和等温扩增的操作要点,这为本工程的名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 顺当完成奠定了技术基础；工程申请人所在试验室为江西省生物化 学与分子生物学重点试验室,试验条件先进,现已完成了进行本工 程讨论的科研平台建设工作；因此,本工程的实施基本上不存在技 术风险；常规检测病原菌的细菌培育分别鉴定法费时费劲,近年进展起 来的 PCR鉴定法易产生非特异性产物,导致假阳性或假阴性结果；与常规检测技术和PCR技术相比,环介导的等温扩增技术具有快速、精确、灵敏、低成本等优点

19、；在本工程的讨论中,我们仍将建 立一次测试能够检测多种致病菌的多重环介导等温扩增新技术；该 技术易于质控,适用于大批量样品同时检测,值得在食品病原菌普 查和人体健康普查工作中推广应用；环介导等温扩增新技术以其明 显的优势将完全能够取代目前使用的常规分析方法和 PCR方法,成 为病原菌检测中的主要检测方法；因此,本工程的成果转化基本上 不存在市场风险；五、工程估计社会效益、环境效益 1、对社会进展的作用 本工程的实施将开发出具有自主学问产权的病原菌检测技术和 配套试剂盒；该检测方法简洁、快速、廉价,不需要昂贵的仪器设 备,易于在基层食品检测部门和医院推广；这对于保证我省食品安 全和人体健康具有重要意义,能够产生明显的社会效益；2、对资源利用情形 本工程是生物高科技产品,技术含量高,产品的生产原料主要名师归纳总结 - - - - - - -第 11 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 是常规生物化学试剂,因此不会破坏自然资源；3、对人才培育情形 本工程的实施,将为我省培育从事现代分子生物学产品开发和病原菌检验人员 3-4 人,培育硕士讨论生 5-6 人；4、环境影响及效益；本工程的讨论和产品开发过程中不会使用有害物质,也不会过度利用自然资源,因此不会对环境造成影响；名师归纳总结 - - - - - - -第 12 页,共 12 页