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.\ 蛋白结合率相关知识 血浆蛋白结合率：药物与血浆蛋白结合的程度，即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数。 血浆蛋白结合率为可逆性疏松结合，结合型药物分子量增大，不能跨膜转运、代谢和排泄，并暂时失去药理活性，某些药物可在血浆蛋白结合部位上发生竞争排挤现象。药物分子与血浆蛋白结合的特点（和药物与受体蛋白结合情况相似）：具有饱和性与可逆性、结合物无活性、有竞争置换现象。 药物进入循环后，有两种形式： 　　结合型药物：药物与血浆蛋白结合。 　　特点： 　　（1）暂时失去药理活性。 　　（2）体积增大，不易通过血管壁，暂时“储存”于血液中。 　　意义：结合型药物起着类似药库的作用。药物进入相应组织后也与组织蛋白发生结合，也起到药库作用，影响药物作用和作用维持时间长短，一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长。 　　游离型药物：未被血浆蛋白结合的药物。 特点：能透过生物膜，进入到相应的组织或靶器官，产生效应或进行代谢与排泄。 药物与血浆蛋白结合方式： 　　酸性药物与白蛋白结合：华法林、非甾体抗炎药、磺胺类药物主要与血浆白蛋白结合，三环类抗抑郁药、氯丙嗪也与白蛋白结合。 　　碱性药物与α1-糖蛋白结合：β-糖蛋白和α-酸性糖蛋白虽然量比白蛋白少很多，但在癌症、关节炎、心肌梗死等疾病中可增高，能与奎宁结合。 　　特点： 　　（1）可逆性 　　药物与血浆蛋白的结合是可逆的，极少数是共价结合（如烷化剂）。 　　药物在血液中转运时，结合型与游离型药物快速达到动态平衡。游离型药物→透过生物膜→血液中游离型药物浓度降低→结合型药物，释出游离型药物。 　　（2）饱和性 　　血浆中蛋白有一定的量，与药物的结合有限，因此，药物与血浆蛋白结合具有饱和性。 　　当药物浓度大于血浆蛋白结合能力时→饱和→游离型药物急剧增加→毒性反应。 　　某些病理情况下，血浆蛋白过少（如肝硬化、慢性肾炎）、变质（如尿毒症） →药物与血浆蛋白结合减少→毒性反应。有些药物在老年人中呈现较强的药理效应，与老年人的血浆蛋白减少有关。 　　（3）竞争性 　　两种药物→竞争结合同一蛋白→置换→游离型药物浓度增加→导致中毒。 　　如：保泰松→结合型双香豆素→游离型→浓度增加→出血倾向。 　　与内源性代谢物竞争与血浆蛋白结合，如磺胺药→置换胆红素→新生儿核黄疸症。 此外，注射白蛋白可与药物结合而影响疗效。 血浆蛋白与药物结合时，血浆蛋白在体内的各种作用暂时消失，但是与药物分离之后，血浆蛋白各种性质基本不变，继续发挥原来的作用。 血浆蛋白结合率的测定 1、实验目的 测定磺胺嘧啶钠在不同动物体内的血浆蛋白结合率。 2、实验原理 将蛋白置于一个隔室内，用半透膜将此隔室与另一隔室隔开。蛋白等大分子不能通过此半透膜，但系统中游离配基可自由通过。当达到平衡时半透膜两侧自由配基的浓度相等。若系统中自由配基的总量已知，测定不含蛋白隔室中自由配基的浓度，即可推算与蛋白结合的配基量。 具有游离氨基的磺胺药在酸性介质中与亚硝酸发生重氮化反应后，可与N-(1萘基）乙二胺产生偶合反应生成紫红色偶氮染料，与经过同样处理的磺胺药标准液比较，用721分光光度计比色法测出组织中和不同时间的血液中磺胺嘧啶浓度。 由于亚硝酸不稳定，在实验中，用三氯醋酸与亚硝酸钠反应制的得。 剩余的过量亚硝酸影响测定，用氨基磺酸胺分解除去。 3、实验材料 1、实验动物 兔子一只。 2、设备与器械 712分光光度计、 管状半透膜（周长5cm，长约12cm）、 丝线 、广口瓶 、 移液器。 3、药物与试剂 10%磺胺嘧啶钠注射液 15%三氯醋酸溶液 0.1%亚硝酸钠溶液 0.5%氨基磺酸胺溶液 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液 磺胺嘧啶钠贮存标准液 磺胺嘧啶钠应用标准液 4、试验方法 1、试剂的制备 0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液：0.5 g溶于95 %乙醇约400 mL中，再用乙醇稀释至500ml，棕色瓶于冰箱中保存 透析液（PBS）：pH7.4的 0.02M 磷酸盐缓冲液，内含0.15M NaCl 磺胺嘧啶钠应用标准液：10%磺胺嘧啶钠注射液3.75μl溶于约80ml3%三氯醋酸溶液再定容于100ml容量瓶中备用 2、血浆制备 兔心脏采血，肝素抗凝，以3000rpm离心10min，取上清液即为血浆。 3、透析 将管状半透膜一端折叠，用纱线扎紧，保留结扎线段10cm左右，以调节袋内外液面在同一水平，加血浆样品2.0ml于上述半透膜袋内，并扎紧口袋另一端，袋口不得污染血浆。将两端扎紧的半透膜置于盛有9.75ml透析液的30ml广口瓶中，用袋两端线段调节袋内外液面，加0.05mg/ml的磺胺嘧啶钠溶液0.5ml于各瓶袋外透析液中。置广口瓶于冰箱中，平衡透析约60h左右。吸出袋外透析液少许，加等量磺基水杨酸试剂，无浑浊，说明无血浆蛋白漏出。取出半透膜，用滤纸吸干袋外壁透析液，小心解开透析袋，使袋内血浆流入干净试管。 4、用重氮化-偶合比色法测定袋内外溶液中磺胺药浓度。 取袋内外溶液各0.5ml，加水15.5ml；加15%三氯醋酸4ml，混匀，静置2min，过滤，取试管3支，各加入滤液5mL，为测定管；取试管3支，加入空白对照液5mL，为空白管；取试管3支，加入应用标准液5mL，为标准管，在以上各管中各加入0.1%亚硝酸钠溶液0.5mL，混匀，放置3min，各加入0.5%氨基磺酸胺溶液0.5mL，混匀，放置2min ，各加入0.1%二盐酸N-（1萘基）-乙二胺溶液2.5mL，充分混匀，放置10min，用721分光光度计在550nm波长处比色：以空白管校正光密度到0点，读取标准管和测定管光密度，并用公式计算： 测定管光密度 游离磺胺药含量 （mg%）= —————— 应用标准液浓度样品稀释倍数 标准管光密度 5、计算血浆蛋白结合率。 Dt - Df fb= --------------100% Dt fb：血浆蛋白结合率； Dt：血药总浓度（透析袋内血浆药物浓度）； Df：游离药物浓度（透析袋外缓冲液中药物浓度） 五、实验结果 1、结果记录 表一：标准管和测定管光密度的测定结果 样一 样二 样三 平均值 透析袋外 0.006 0.008 0.011 0.008 透析袋内 0.065 0.090 0.061 0.072 标准液 0.690 0.701 0.680 0.690 2、游离磺胺药含量的计算 计算得：透析袋内药物浓度=0.000044mg/ml 透析袋外药物浓度=0.00039mg/ml 3、药物血浆蛋白结合率的计算结果： 兔：fb=88.9% 六、结果讨论与总结 1、分光光度计的使用操作。 由于应该使用一套比色杯来测定吸光度，而在实际操作中比色杯使用混乱，而且并没有做到严格的润洗，所以吸光度的测量存在较大的误差。 分光光度计的使用应该注意的事项： （1）为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命。 （2）拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。 （3）清洗比色皿时，一般先用水冲洗，再用蒸馏水洗净。每次做完实验时，应立即洗净比色皿。 （4）测定有色溶液吸光度时，一定要用有色溶液洗比色皿内壁几次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测定一系列溶液的吸光度时，通常都按由稀到浓的顺序测定，以减小测量误差。 （5）在实际分析工作中，通常根据溶液浓度的不同，选用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。 2、总结 动物的种属、生理病理状态、个体差异可以影响血浆蛋白结合率。理论上当蛋白浓度足够高时所有与蛋白作用的药物都能被结合。但实际情况下，当亲和力较低时不可能达到这种所谓的足够高的蛋白浓度。蛋白浓度一定时，一定范围内当药物浓度增加结合的药量会随之增加，但结合分数降低。相反，当药物浓度下降时，结合分数增加并逐渐趋向于一个最大值, ，因此不同药物在低浓度时的最大结合率各不相同。平衡透析法是一种相对简单不需要复杂设备的可行性强的操作方法。 实验过程中所用三角瓶、移液管、试管等并没有经过彻底清洗会对实验结果造成影响，不同的动物种类以及相同的动物的个体差异会对实验结果造成影响，还有操作人员的失误也会对实验结果造成影响，药物浓度和血浆蛋白浓度对结合率都有影响。在报导血浆蛋白结合率时，必须同时注明实验过程中所用的药物浓度和蛋白浓度。