食品微生物学检验GB4789系列学习知识重点汇总.doc

-/ 食品微生物学检验GB 4789 系列知识点汇总 GB 4789.1-2016 食品卫生学检验 总则 一、2016版总则变更内容 1.删除了标准中的英文名称、起草单位变更为中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局。 2.删除了规范性引用文件。 3.修改了实验室基本要求： 应具有相应的微生物专业教育或培训经历（如生物学、植物学、医学、食品科学与工程、食品质量与安全等与微生物有关的相关专业），具备相应的资质（应有岗位上岗证、生物安全上岗证和压力容器上岗证），能够理解并正确实施检验。 ①人员修改为检验人员 应掌握实验室生物安全操作和消毒知识（相关标准及培训，如GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求、消毒技术规范（2002））。 应在检验过程中保持个人整洁与卫生，防止人为污染样品。 应在检验过程中遵守相关安全措施的规定，确保自身安全。 有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色的实验（即无颜色视觉障碍）。 ②环境与设施--突出温度、湿度和洁净度。 生物危害程度应与实验室生物防护水平相适应: 第一类：引起人和动物非常严重疾病，国家未发现或已宣布消灭的微生物，如天花病毒。 第二类：引起任何动物比较严重疾病，在人和人、人和动物之间传播如霍乱弧菌。 病原微生物分类 第三类：引起疾病，但对人、动物或者环境不构成严重危害如沙门氏菌、单增李斯特氏菌。 第四类：通常不会引起人或动物疾病的微生物。 一级（BSL-1）：操作第四类病原微生物（属于正压，适用范围如大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌等。重要设备是超净工作台，它可以保护样品不受污染。） 实验室生物安全级别 二级（BSL-2）：操作第三类病原微生物（属于负压，适用范围如沙门氏菌、等致病菌。重要设备是II级生物安全柜。） 三级（BSL-3）：操作第二类病原微生物 四级（BSL-4）：操作第一类病原微生物 消毒：是杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其中的孢子。 灭菌：是杀死和去除所有微生物及其中孢子的过程。 紫外线消毒（臭氧） 环境：洁净室消毒 空间熏蒸（如空间被霉菌污染可用甲醛熏蒸法消毒） 消毒剂表面消毒 微生物实验 湿热灭菌或常用室消毒灭菌方式 平皿工器具灭菌和设备消毒 高压灭菌 干热灭菌（180℃1h或170℃2h） 湿热灭菌或高压灭菌 培养基和试剂灭菌 煮沸灭菌 过滤除菌 紫外线消毒法：紫外灯管放射一定波长，破坏细菌或病毒的DNA和RNA，使他们丧失生存能力和繁殖能力，从而达到灭菌目的。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌芽孢对其抵抗力大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。 微生物实验室消毒处理方法： 最佳杀菌波长：260nm，需定期更换。 有效杀菌距离 物品：25-60cm 空气：＜2m 照射时间：灯亮5-7min后开始计算，＞30min（无人条件下打开） 适用范围：室内空气、物体表面。 注意事项：人员需在关闭紫外灯至少30min后方可入内作业。 ③检验用品--增加附录A和一次性用品。 附录A 微生物实验室常规检验用品和设备 高压锅 灭菌效果评价方法 化学指示剂：即化学指示卡/胶带，使用方便，高压后可立即得知检测结果。 生物指示剂：准确性高，高压后需要培养后才得知检测结果。 ④培养基和试剂质控-GB4789.28-2013。 ⑤质控菌株-新增实验室分离、鉴定的野生菌株。 4.修改了样品采集 ①采样原则：样品的采集应遵循随机性、代表性的原则；采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 ②采样方案：根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的威海程度等确定采样方案。 采样方案分为二级好三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。（其中n表示桶一批次产品应采集的样品件数；c表示最大可允许超出m值得样品数；m表示微生物指标可接受水平限量值(三级采样方案)或最高安全限量值(二级采样方案)；M表示微生物指标的最高安全限量值。） 注意事项：按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。 按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值≤m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。 5.修改了检验—“样品检验” 6.修改了生物安全和质量控制（优化） 7.修改了记录与报告 检验过程中应即时、客观地记录观察到的现象、结果和数据等信息。 实验室应按照检验方法中规定的要求，准确、客观地报告检验结果。 8.修改了检验后样品的处理 检验结果报告后，被检样品方能处理； 检出致病菌的样品要经过无害化处理； 检验结果报告后，剩余样品和同批产品不进行微生物项目的复检。 二、2016版总则具体要求 各种微生物危害分类 采样分级 危害程度 微生物学指标 三级 食品保质期 菌落总数、霉菌和酵母 间接指示菌 大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌、肠杆菌科、金黄色葡萄球菌 中等程度局限传播 葡萄球菌肠毒素、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、产气夹馍梭菌 二级 中等程度广泛传播 沙门氏菌、诺如病毒、肠出血大肠埃希氏菌 严重程度 O1型霍乱、肉毒梭菌 单核细胞增生李斯特氏菌 婴儿食品沙门氏菌赫尔阪崎肠杆菌 在中等以上甚至严重危害的情况下，使用二级采样方案。 对健康危害低的，则建议使用三级采样方案。 分级抽样方案：同批食品总微生物数量一般是正态分布，表明同批次具有均一性。但对于单一检样来说，微生物分布或数量一般不会均匀（液态食品除外）。这样的不均一型造成检验结果判读困难。N越大越准确，但是应考虑适度严格性的要求。 三、2016版总则相关质量控制 检验人员的质量控制（实施考核、监督方式）： 1.问答、试题 2.盲样测试 3.加标测试 4.实验室内部人员对比r≤0.25 参考BS EN ISO 4833-2003，其中对结果重复性的规定为：用相同的方法，同一试验材料，在相同的条件（同一操作者、相同的设备、同一实验室和短暂的时间间隔）下，所测得的两个独立测试结果只差的绝对值不能大于重复性极限（r=0.25）。 举例：第一次测试结果为105=100000CFU/g(ml) 第二次测试结果应在第一次结果的0.25log10单位范围内 即在log104.75- og105.25范围内 即第二次测试结果在56000-178000CFU/g(ml)范围内视为无差异。 5.实验室间对比R≤0.45 参考BS EN ISO 4833-2003，其中对结果重复性的规定为：用相同的方法，同一试验材料，在不同的条件（不同的操作者、不同的设备、不同的实验、不同或相同的时间）下，所得的两个测试结果只差绝对值不能大于再现性极限，即R=0.45。 举例：第一次测试结果为105=100000CFU/g(ml) 第二次测试结果应在第一次结果的0.45log10单位范围内 即在log104.55- og105.45范围内 即第二次测试结果在36000-280000CFU/g(ml)范围内视为无差异。 GB 4789.2-2016 食品微生物学检验菌落总数测定 一、菌落总数的定义 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g(ml)检样中形成的微生物菌落总数。 在GB 4789.2-2016的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。 注意：有的平板计数琼脂上长一片霉菌，则此次试验结果作废，需重新检测（霉菌属于真菌类，它产生的霉菌毒素一直普通菌的生长，所以若有一大片霉菌生长需重新检测，并清理实验室。） 二、菌落总数测定的卫生学意义 检测食品本身的新鲜程度和加工、贮存运输过程中是否受到污染。 必须配合大肠菌群的检验和其他病原菌项目的检验，才能作出比较全面准确的判定。 三、2016版国家标准的主要变动 ①拍击式均质：方便，只需购置一次性无菌均质袋；快捷，1-2min内完成均质；科学，均质过程中不会产生高温；均质均匀，可使样品菌完全稀释出来；此方法不适合均质坚硬样品，如鱼骨类样品。 ②培养基---平板计数琼脂 营养琼脂NA 2003版 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼 脂 15.0g 蒸馏水 1000ml 平板计数琼脂PCA 2010版和2016版 胰蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 2.5g 葡 萄 糖 1.0g 琼 脂 15.0g 蒸 馏 水 1000ml 培养基改变依据：国外食品微生物检验的权威方法（ISO、FDA、AOCAC）均采用PCA，它的营养更优化。 ③计数和报告-----平板和菌落选取原则 ●选取每个平皿菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板进行计数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 ●有较大片状生长菌落的平板不易采用。 ●如片状菌落不足平板一般，而另一半平板菌落分布均匀，可计分布均匀的一半，再乘以2。 ●如平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则每条单链作为一个菌落计算。 ④计数和报告-----菌落总数计算方法 ●如果只有一个稀释度平板的菌落数在30-300CFU适宜范围内，则计算该稀释度两个平板菌落平均数，再乘以稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。 ●若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30-300CFU适宜范围内，按公式N=∑C/(n1+0.1n2)d计算。N:样品中菌落数，∑C：含适宜范围CFU的平板菌落数之和， n1：第一稀释度（低稀释度）平板个数， n2：第二稀释度（高稀释度），d：稀释因子（第一稀释度）。 ●所有平板菌落数均＞300，计最高稀释度平板的平均菌落数。 ●所有平板菌落数均＜30，计最低稀释度平板的平均菌落数。 ●样品原液和所有稀释度平板均无菌生长，以＜1乘以最低稀释倍数计算。 ●所有稀释度平板菌落数均不在20-300之间，有些＜30，有些＞300，则最接近30-300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 ⑤计数和报告-----结果报告（采取四舍五入法） 编号 菌落总数 报告方式 单位 1 95.5 96 CFU/g或CFU/ml（单位需大写CFU） 2 1680 1700或1.7X103 3 均为蔓延菌落无法计数 报告“菌落蔓延” 4 空白对照有菌 结果无效 四、2016版国家标准的检验流程 检样25g（ml）样品+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2-3个适宜稀释度样品均液，各取1ml分别加入无菌培养皿中 每个培养皿中加入15-20ml平板计数琼脂培养基，混匀。 培养 计数各平板菌落数 计算菌落总数 报告 五、其他注意事项 1.如样品（干调、面粉、脱水蔬菜）中可能含有在琼脂表面蔓延生长的菌落，可在凝固后的琼脂表面再覆盖一层（4ml）培养基。这样可以有效防止菌落蔓延的现象出现。 2.稀释液选择 磷酸盐缓冲液：适用于偏酸或偏碱性样品的稀释。 生理盐水：适用于常规样品的稀释。 3.倾注平板计数琼脂在15-20ml，一般要求达到18ml以上，即琼脂高度＞3mm。若倾注的培养基太薄，菌需要的营养成分不够，使菌生长的不完好，不便于观察结果。 4.样品与培养基一定要混合均匀，建议混匀方法：上下摇晃-左右摇晃-顺时针摇晃-逆时针摇晃。若混合不均匀，有的菌落会长到平板边缘，不便于观察，影响最终结果。 5.培养基水浴温度和倾注温度在461℃。培养基的冷却方法：要在恒温水浴锅中通过水来冷却；不可直接放到试验台或地面上冷却，因这样培养基底部容易先凝固，倾注培养基时，有凝固块到处，导致培养基有结块，即不美观，有影响观察结果。 6.培养条件：一般样品361℃培养482h，水产品（指原生态、未经过加工的水产品原料），它的培养温度要接近原生态的温度，即301℃，培养723h。 7.样品稀释液有时会带有细碎的食物颗粒（如奶粉、坚果），为避免这些颗粒与菌落发生混淆，可将样品稀释液与PCA混合，单做培养，置于4℃冰箱放置同样时间，以便在计数时作为对照。（营养琼脂可加红四氮唑来区别菌和颗粒，一般不建议使用） 8.必须做空白对照：检测培养基、平皿、稀释液的无菌程度。同时，应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应与检样时间相当），以了解样品在检验过程中有无受到来自环境的污染。 GB 4789.3-2016 食品微生物学检验大肠菌群计数 一、大肠菌群定义 1.定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 2.该菌主要来源于人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。即大肠菌群为卫生学指标。 3.这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化鉴定试验，可将大肠菌群细分为大肠埃希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和肠杆菌等。 二、2016年国标主要修订内容 1.标准替代：GB 4789.3-2010；GB/T 4789.32-2002；SN/T0169-2010 2.增加检验原理 MPN法：是统计学和微生物学结合的一种定量检测法，待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 平板计数法：大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。 3.修改典型菌落描述：如菌落直径较典型菌落小，为可疑菌落，也要挑取进行验证。 4.修改第二法平板菌落数的选择：最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。 5.修改第二法验证试验：若少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落进行验证。若大于10个菌落，则挑取10个典型和可疑菌落进行验证。 三、大肠菌群检测流程 ●MPN法 PH应在6.5-7.5之间，必要时可用1mol/L的NAOH或HCL调节 检样25g（ml）+225ml稀释液，均质 10倍梯度稀释 选择适宜三个连续稀释度的稀释液，接种到LST肉汤中 24h为预判若产气进行验证；若未产气继续培养至48h查看结果。 361℃ 24-48h BGLB肉汤 产气 不产气 361℃ 482h 产气 不产气 大肠菌群阳性 大肠菌群阴性 查MPN表，报告结果 1.初发酵试验： A、月桂基硫酸盐胰蛋白胨LST（成分：胰蛋白胨或胰酪胨、氯化钠、乳糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠）作用： ①胰酪胨在培养基中作为基础营养物质提供细菌生长所需的氮源、维生素、氨基酸等生长因子。 ②乳糖作为可发酵的碳源。 ③NaCl维持体系渗透压平衡。 ④磷酸盐为菌体生长提供一个相对稳定的酸碱缓冲体系。 ⑤月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长。 大肠菌群类细菌利用培养基中的乳糖产气而与其它不产气的细菌相区别。 B、接种方式：1ml稀释液+10mlLST；10ml稀释液+10ml双料LST。 C、培养条件：36℃，培养24-482h。 D、结果观察：小导管 是否产气。 2.复发酵试验： A、煌绿乳糖胆盐肉汤BGLB（成分：蛋白胨、乳糖、牛胆粉溶液、0.1%煌绿水溶液）的作用： ①蛋白胨在培养基中作为基础营养物质提供细菌生长所需的碳源、氮源。 ②牛胆盐和煌绿抑制革兰氏阳性菌及非大肠菌群的革兰氏阴性菌的生长。 ③乳糖作为可发酵的碳水化合物。 B、接种方式：1环产气的LST+10mlBGLG。 C、培养条件：36℃，482h。 D、结果观察：小导管是否产气。 3.结果报告 表 大肠菌群最可能数MPN检索表 阳性管数 MPN 95%可信限 阳性管数 MPN 95%可信限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0.10 0.01 0.001 下限 上限 0 0 0 <0.3 - 9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 2 0 1 15 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 - 注1：本表采用3个稀释度0.1g（ml）、0.01g（ml）、0.001g（ml），每个稀释度接种3管。 注2：表内所列检样量如改用1g（ml）、0.1g（ml）、0.01g（ml）时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g（ml）、0.001g（ml）、0.0001g（ml）时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。 根据阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中含菌量的最近似数值。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用其他稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 检样25g（ml）+225ml稀释液，均质 ●平板计数法 需同时用生理盐水做空白对照 10倍梯度稀释 选择2-3个适宜连续稀释度的样品匀液，接种VRBA平板上 计数典型和可疑菌落 361℃ 18-24h BGLB 肉汤 报告结果 361℃ 24-48h 1.培养基：结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） ①原理：乳糖作为可发酵碳源；胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌生长；中性红为酸碱指示剂。 ②大肠菌群特点：紫红色菌落，周围红色胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。 ③培养基倾注方法：每个平皿倾注15-20ml，凝固后再加3-4ml覆盖，防止菌落蔓延生长，影响结果。 2.平板菌落数的选择 ①选取菌落数在15-150CFU之间的平板计数。 ②分别计数平板上出现的典型和可疑菌落（如菌落直径较典型菌落小）。 ③最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。 3.验证试验 ①从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。 ②移种于BGLB肉汤管，361℃培养24-48h，观察产气 ③凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 4.平板计数的报告 BGLB阳性管数比例乘以计数的平板菌落数，乘以稀释倍数，即为每g（ml）样品中大肠菌群数。 例如： 样品稀释度 典型和可疑菌落数 选取验证菌落 BGLB阳性管 结果CFU/g(ml) 10-4 100 10 6 100*(6/10)*104=6.0*105 10-1 0 0 0 <10 注意事项： ①样品PH调节方法：添加NaOH调节 ②在361℃培养24-48h的意义：24h为预判，若预判未产气继续培养到48h最终确定结果。 ③若典型菌落和可疑菌落超过10个，应挑取10个典型和可疑菌落接种验证；若少于10个菌落的则挑取全部典型和可疑菌落接种进行验证。 ④大肠菌群类细菌可发酵乳糖产气，因此主要看小导管产气情况来确定大肠菌群。若BGLB肉汤变成黄绿色，则产酸导致。 ④在乳糖发酵试验中，经常可以看到在小导管内有极微小的气泡，有时可以看到沿管壁有缓缓上浮的小气泡。如果对产气不明显的乳糖发酵现象有疑问，可以轻轻拍打试管，如有气泡沿管壁上浮，即可能有气体产生。 GB 4789.4-2016 食品微生物学检验沙门氏菌检验 一、沙门氏菌简介 1.细菌学分类：肠杆菌科沙门氏菌属下设6个亚属：I、II、IV、V、VI及III（原亚利桑那菌属）。 2.致病性：胃肠炎、伤寒、败血症（伤寒氏沙门易患败血症）等人类疾病，严重时能导致死亡。 3.种类：种类繁多，抗原结果复杂，在《ANTIGENICFORMULAE OF THE SALMONELLA SEROVARS》(2007 9th edition)中已公布了2579个血清型。 4.感染途径：食物，主要是生肉和生蛋。 5.生物学特征： ①形态特征：革兰氏阴性、短杆菌，无芽孢，一般无荚膜；除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌外都有周身鞭毛，运动力特强。 ②需氧或兼性厌氧，10-42℃都可以生长，最适生长温度为37℃，最适PH为6.8-7.8。 综上所述：沙门氏菌为革兰氏阴性、需氧或兼性厌氧、无芽孢的短杆菌。 二、沙门氏菌的检验步骤及注意事项 样品处理 前增菌 25g（ml）样品+225mlBPW 361℃ 8-18h 选择性增菌 1ml前增菌液+10mlTTB 1ml前增菌液+10mlSC 421℃，18-24h 361℃，18-24h BS XLD（或HE、沙门显色培养基） 选择性分离 361℃，40-48h 361℃，18-24h 挑取可疑菌落 TSI，赖氨酸，NA，靛基质，尿素（PH7.2），KCN 生化鉴定 H2S+ H2S+ H2S- 反应 试剂盒或 靛基质- 靛基质+ 靛基质- 结果 全自动微 尿素- 尿素- 尿素- 与左 生物生化 KCN- KCN- KCN- 侧描述 鉴定系统+ 赖氨酸+ 赖氨酸+ 赖氨酸+/- 不符 甘露醇+、山梨醇+ ONPG- 沙门氏菌 非沙门氏菌 生化鉴定 多价血清鉴定 血清学分型（选做） 血清学鉴定 报告 1.前增菌注意事项： ①若样品为液态，不需要均质，振荡混匀即可。 ②如需测定PH值，用1mol/L无菌NaOH或Hcl调节PH至6.80.2. ③无菌操作将样品转至500ml锥形瓶中；如使用均质袋，可直接培养，361℃培养8-18h。 ④任何样品均需要进行前增菌，然后才能进行后续实验。 ⑤缓冲蛋白胨水BPW作用：它不含任何抑菌成分，有利于受损的沙门氏菌复苏，使受损伤细胞恢复到稳定的生理状态。 ⑥冷冻样品的解冻：45℃以下不超过15min，或2-5℃不超过18h。 ⑦培养时间严格控制在18h以内，因为18h以后沙门氏菌开始衰退，并且杂菌增多，影响检测结果。 2.28页 三、沙门氏菌检验过程中的常见问题