常用肝纤维化动物模型制作的研究进展.doc

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1、常用肝纤维化动物模型制作的研究进展王 昆（贵阳中医学院病理教研室 550002）摘要：对目前建立肝纤维化动物模型的几种常用方法的机理、途径、效果、优缺点等进行综述，并阐述了目前建立肝纤维化模型的现状及存在的问题。关键词：肝纤维化；动物模型；综述肝纤维化,是指各种致病因,素引起肝脏损害和炎症，在修复过程中导致肝脏细胞外基质和异常物质异常增多和过度沉积的病理过程。肝纤维化是多种慢性肝病的共同病理基础与特征, 表现为以胶原为主的肝脏细胞外基质各成分合成增多,降解相对不足,过多沉积在肝内。若进一步发展引起肝小叶改建、假小叶与结节形成,最终必然导致肝硬化。对肝纤维化进行早期诊断,早期治疗可以预防肝硬化的

2、发生、发展,能够提高肝病患者的生存时间和生命质量,具有重要的临床意义和价值。而肝纤维化动物模型的建立,是开展肝纤维化基础研究及实验治疗研究的重要手段,既可以深入研究其发病机理,又可以为临床筛选防治肝纤维化药物。近年来，肝纤维化动物模型研究取得了很大进展，现将其综述如下：1化学药物或毒物所致的肝纤维化模型1. 1四氯化碳( carbon tetrachloride, CCl4 )诱发肝纤维化动物模型原理是CCl4 进入机体后在肝内活化成自由基,后者可直接损伤质膜,启动脂质过氧化作用,破坏肝细胞膜性结构等,造成肝细胞变形坏死。是经典的肝纤维化模型,它简便、易行、价廉且耗时短,病变典型,目前被广泛使

3、用。但死亡率较高,停止造模给药后,有自然恢复的趋势。造模途径多样化 12形成肝纤维化模型时间也依给药途径不同而有差异,时间6周16周不等 3 。郭美姿等 1 采用体积分数60% CCl4 植物油液给大鼠灌胃,首次0. 5 ml/100 g,以后0. 2 ml/100 g, 2次/周,共6周。同时给与5% 乙醇。见肝小叶结构紊乱,广泛肝细胞脂肪变性坏死,伴较多炎性细胞浸润,汇管区扩大,纤维组织明显增生,较粗纤维间隔形成,并向外延伸分割肝小叶。蔡瑜等 2 给大鼠皮下注射40% CCL4 橄榄油溶液0. 3 ml/100 g, 2次/周。首剂加倍,发现大鼠肝脏炎症和纤维组织增生程度随实验时间延长逐渐

4、加重,第8周形成假小叶。1. 2 二甲基亚硝氨（DMN）诱导肝纤维化动物模型DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性，其活性代谢产物使酸、蛋白质等重要的生命物质发生甲基化反应，随后导致肝细胞坏死，细胞外基质进行性增加。DMN 诱导大鼠肝纤维化模型的给药途径为腹腔注射，与CCL4不同的是DMN不造成肝细胞脂肪变，不引起肝内凝固性病变，它主要引起肝内出血性病变、肝细胞的严重坏死，进一步引起细胞外基质蛋白尤其是胶原在肝脏的沉积。在中断毒物接触后的几个月，肝纤维化仍可保持稳定进展。且肝脏组织病理学的变化与人类酒精性肝硬化明显相关。1. 3 N-乙基亚硝胺(N-ethylnitrosamine)诱发肝纤维化

5、动物模型实验中经常使用二乙基亚硝胺( diethylnitrosamine, DEN)诱导肝纤维化。DEN 可通过与DNA、RNA 及许多蛋白质结合, 造成DNA损害,影响RNA转录。Gl、S及G2 /M检测点在DNA 受损后,多种因子、多种途径被激活,在组织细胞进入下一时期,DNA复制前受损DNA使其得到修复和清除。DEN广泛存在于食物中,可诱发多种动物肿瘤,大鼠所诱发的肿瘤多为肝细胞瘤,和人肝细胞癌比较相似。DEN具有致癌性,实验中注意个人保护。方肇勤等4用DEN诱发大鼠肝癌对比研究不同中药治疗作用中, 0. 01% DEN诱发肝癌模型,经过非特异性坏死期,肝纤维化期,肝细胞非典型增生期,

6、肝癌期几个过程。1. 4酒精中毒和(或)营养不良性肝纤维化模型一般认为其发生过程是肝星状细胞活性增强,细胞外基质成分特别是胶原纤维过剩产生,同时细胞外基质分解酶,如MMPs的活性相应也增强,当纤维合成和分解失衡,则发生纤维化。血小板由来的因子PDGF, 是Kupffer细胞、肝血窦内皮细胞及肝星状细胞自身产生的TGF-等许多因子激活肝星状细胞,均可通过旁分泌或自主分泌机制促进肝纤维化。酒精提供的卡热可作为酗酒者50%的食物能量来源,造成酗酒者营养不良。长期营养不良,能引起肝细胞坏死、脂肪肝,直至发展为营养不良性肝硬化。根据国人饮酒习惯,利用该模型可以较系统地观察和探讨酒精性肝病早期肝纤维化存在

7、及动态变化,能够给予及时干预治疗,液体食料中还可添加促进酒精性肝损伤的辅剂,造模时间一般在10周左右。15D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-Galn) 实验性肝纤维化动物模型D-Galn诱发动物肝损害在形态学和功能上被认为与人急性肝炎相似。通过促进内毒素产生,激活Kupffercell,导致一系列炎性因子释放,促进活性氧产生,引起肝脏过氧化增强,代谢紊乱,造成肝细胞内某些代谢产物缺乏,诱发药物性肝炎。了解导致肝损害的机理,就可有的放矢选用相应对抗药物进行防御。晏春根等 5 在D-Galn /内毒素介导急性肝损伤中观察Toll样受体4表达。D-Galn肝损害时,释放大量的巨噬

8、细胞和细胞因子。2. 胆管阻塞性肝纤维化模型结扎是给胆总管机械性剌激,人为造成肝外胆道梗阻,最终形成肝纤维化,具有炎症反应少、纤维化形成快、自发逆转率低特点, 安全无毒、死亡率低,是肝纤维化病理生理学和药理学研究较理想模型之一。多用于外科学阻塞性肝病造模,造模时间短,能得到良好的实验效果。这要求实验者熟练掌握解剖学及外科学知识,才能不浪费人力,物力,节省时间。给雄性Wistar大鼠予以氯胺酮0. 2 ml/100 g腹腔注射麻醉后,结扎胆总管并切断,远端再予以结扎,结扎后3, 7, 14, 21 d处死大鼠, ,胆总管结扎3 d肝内胆管扩张,少量细胞凋亡,细胞浆浓缩,核染色质向核仁或核周边聚集

9、; 7 d细胞凋亡增加,肝细胞内或细胞间瘀胆, 纤维组织增生,胆小管扩张及中度增生,胆栓形成; 14 d细胞凋亡达到高峰,汇管区周围肝细胞变性,纤维组织增生向肝小叶内扩展; 21 d细胞凋亡有所减少,纤维组织带增宽,肝脏结构广泛改变,肝细胞数目明显减少。3实验性免疫肝纤维化模型发病机理与免疫反应有关。免疫损伤机体产生III型变态反应,主要在门脉汇管及中央静脉周围,大量抗原抗体复合物沉积,引起炎症反应,刺激胶原的增生,可见汇管区肌成纤维细胞。异种血清,包括猪、牛、马血清;异种蛋白,包括猪血清、血清球蛋白、人丙种球蛋白。多位学者采用人血白蛋白注射鼠、兔肝内感染制作免疫性肝纤维化病理模型。此模型在致

10、病因素上属于一种免疫损伤,与人类肝纤维化病因有一定相似之处,有自愈倾向,造膜周期较长。郑元义等 6 在大鼠腹腔首剂注射猪血清2 ml,以后每次1ml/100 g, 2次/周,共7周。12周后大量胶原纤维形成,分割肝小叶成假小叶,以大方型假小叶为主。有学者应用人血白蛋白免疫攻击方法制备免疫性肝纤维化模型,肝组织汇管区中纤维组织增生,同时纤维组织与中央静脉周围增生并向肝小叶内延伸,但纤维间隔较纤细 7-8 。4转基因动物模型转基因动物模型基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片断)用纤维注射等方法注入实验动物的受精卵(或着床前胚胎细胞) ,然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物输卵管(或

11、子宫)内,使其发育成携带有外源基因的转基因动物。TGF-是肝纤维化形成过程中最重要的细胞因子之一。TGF-通过自分泌和旁分泌方式,对细胞分裂增殖具有促进或抑制双重作用,并且调节肝脏贮脂细胞基因表达类型和表达水平,激活肝脏贮脂细胞并使其向纤维母细胞转化、合成大量细胞外基质、通过产生基质金属蛋白酶(MMP) 降解细胞外基质有重要影响。利用转基因动物模型不但可以阐明某些疾病的病因,还可根据病因进行转基因治疗。5血吸虫虫卵诱发肝纤维化模型血吸虫感染实验动物，虫卵随血流至肝脏沉积导致肝损害，特点是肝内门静脉分支与门脉区纤维增生，门脉周围硬化产生门脉阻塞。此模型最接近人类血吸虫病性肝纤维化，适用于研究血吸

12、虫病性肝纤维化的形成机制以及防治和药物筛选。综上所述，理想的肝纤维化模型病理改变呈阶段性，具有可逆与不可逆的阶段性演进过程，与人类疾病所致纤维化的形态特点一样，模型动物的表现符合中医“证”的特征，且造模方法简单，模型形成率高，重现性好。但迄今为止，还没有与人类肝纤维化完全相似的模型，动物模型制作与人肝纤维化的病理生理过程还有相当大的差距。肝纤维化的形成是多因素所致，而目前的肝纤维化动物模型大多采用单一因素处理致病；无法应用人类最常见的肝炎病毒复制肝纤维化动物模型，而代之以化学中毒性肝损伤、免疫性肝损伤等，这与人类肝纤维化的发病机制存在差异；无法复制出既具有肝纤维化病理特点，又与中医证型相符合的

13、动物病理模型。总之，理想的肝纤维化动物模型的建立是临床研究和实验研究中的一个难点，尚需进一步深入研究，所以今后应进一步加强肝纤维化模型的研究,从而为临床抗肝纤维化的治疗提供依据。参考文献:1 郭美姿,李孝生,沈鼎明,等. 大黄酸对大鼠肝纤维化形成的影响 J . 中华肝脏病杂志, 2003, 11 (1) : 26.2 蔡瑜,沈锡中,王吉耀. 用cDNA微矩阵研究肝纤维化基因表达的变化 J . Chinese Hepatology, 2003, 8 (1) : 18.3 刘平,高云华. 肝纤维化动物模型的建立 J . 世界华人消化杂志, 2002, 10 (6) : 693.4 方肇勤,管冬元,

14、梁尚华,等. 不同中医治法DEN诱发大鼠肝癌作用的比较研 J . 中医杂志, 2002, 43 (7) : 542.5 晏春根,谢青,周霞秋,等. Toll样受体4在D2氨基半乳糖/内毒素介导的急性肝损伤中的表达 J . 中华传染病杂志, 2004, 3 (22) :189.6郑元义,戴立里,王文兵,等. 丹参素治疗肝纤维化及其作用机制研究 J . 中华肝脏病杂志, 2003, 11 (5) : 288.7康文臻,谢玉梅,聂青,等. 苦参素对实验性大鼠肝纤维化防治作用的研究 J . 世界华人消化杂志, 2003, 11 (2) : 195.8王宝恩,王志富,殷蔚荑,等. 实验性免疫性肝纤维化模型的研究 J . 中华医学杂志, 1989, 69 (9) : 503.