腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因治疗骨缺损的研究.pdf

《腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因治疗骨缺损的研究.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因治疗骨缺损的研究.pdf（6页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、上海交通大学学报(医学版)V0129 No2 Feb2009 Journal of Shanghai Jiaotong University(Medical Science) 171文章编号：02585898(2009)02017106 论 著腺病毒介导的骨形态发生蛋白一2基因治疗骨缺损的研究焦鲲， 罗树林。 尹峰(同济大学东方医院骨科，上海200120)摘要：日曲探讨以胶原海绵为支架，用含腺病毒介导的骨形态发生蛋白(BMP)-2的鼠肌母细胞修复小鼠胫骨缺损的可行性。方法制备鼠BMP-2腺病毒质粒并经PCR鉴定；将体外培养肌源性干细胞的贴壁细胞传代，取第3代细胞，在鼠肌母细胞中表达重组AdBM

2、P2质粒并孵育。采用间接免疫荧光法测定BMP-2阳性细胞的数量，碱性磷酸酶(ALP)法测定各组细胞ALP活性。建立胫骨近端骨缺损小鼠模型(n=80)，分为4组：AdBMP-2转染组、AdLacZ转染组、空白组和AdBMP-2植入组。术后第3周观察各组小鼠植入区组织学变化和模型处放射学改变。结鼍间接免疫荧光法测定显示，Ad-BMP2转染组中BMP一2阳性细胞多见，而AdLacZ转染组和空白组中未见阳性细胞，仅见微弱的背景染色。AdBMP-2转染组中ALP活性含量较高，而AdLacZ转染组和空白组ALP活性含量极低。AdBMP-2转染组模型处有明显的骨缺损修复、愈合成像，AdBMP一2植入组次之，

3、AdLacZ转染组和空白组表现不明显。结论构建的AdBMP-2质粒能高效转染小鼠肌母细胞，且转染后的细胞能在机体持续分泌有效量的BMP-2。腺病毒介导的转染BMP-2的鼠肌母细胞具有明确的骨缺损修复能力，为I临床促进骨折愈合提供了一种有效的方法和材料。关键词：骨形态发生蛋白； 鼠肌母细胞；腺病毒；骨缺损中图分类号：R683；Q789；R一332 文献标志码：AExperiment of treatment of bone defect with adenovirus-mediated expression ofbone morphogenetic protein-2JIAO Kun，LUO S

4、hu。lin，YIN Feng(Department of Orthopedics，The Oriental Hospital，Shanghai 200120，China)Abstract： Objective To explore the feasibility of mouse musclederived cells with adenovirusmediated expression of BMP-2in the treatment of mouse tibia bone defect via collagen sponge as scaffold Methods Mouse adeno

5、virus BMP一2 plasmidswere prepared and identified by PCRThe adherent cells of musclederived stem cells cultured in vitro were passaged，cells ofthe third generation were selected，and recombinant Ad-BMP-2 plasmids were expressed and incubated in mouse myoblastsThe number of BMP-2 positive ceils was mea

6、sured using indirect immunofluoreseence method，and alkaline phosphatase(ALP)method was adopted to determine the cell activity in each groupThe mouse models of proximal tibial bone defect wereestablished(n=80)and were divided into AdBMP-2 transfcction group，AdLacZ transfeetion group，blank group and A

7、dBMP-2implantation groupThe histological and radiological changes were observed 3 weeks after operation Resul幻It was revealedby indirect immunofL10resoenee that BMP-2 positive cells were frequently found in AdBMP-2 transfection group，while nonewere observed in AdLacZ transfection group and blank gro

8、upThe ALP activity was hisher in AdBMP-2 transfection group，while that was extremely low in Ad-LacZ transfection group and blank groupThere was most typical imaging of repair andhealing of bone defect in AdBMP-2 transfection group，followed by AdBMP-2 implantation group，while there was no typicalimag

9、ing in AdLacZ transfection group and blank group Conclusion The constructed AdBMP2 plasmids can effectivelytransfeet mouse musclederived cells，and the transfected cells Call continuously express effective amount of BMP-2The mousemusclederived cells with adenovirusmediated expression of BMP2 play a d

10、efinite role in the treatment of bone defeet，whichprovides all effective method and material for clinical applicationKey words： bone morphogenetic protein-2； mouse muscle-derived cells； adenovirus； bone defect骨缺损的治疗一直是骨科领域的一大难题。因感染、肿瘤、暴力损伤和骨质疏松等原因导致的较大骨缺损，若未经治疗，结局多为骨不连。目前临床治疗骨缺损主要以自体和异体骨移植为主，但通常愈后较差

11、，且供骨区经常发生感染等并发症。骨科学的基础研究已经发现骨形态发生蛋白(bone morpho-genetic protein，BMP)具有良好的异位诱导成骨作用，并成功地将其应用于I临床骨不连和骨缺损等疾病的作者简介：焦鲲(1976一)，男，住院医师，硕士生；电子信箱：jiaokunl976163Corn。万方数据上海交通大学学报(医学版)治疗。本研究旨在探讨以胶原海绵为支架，用含腺病毒介导的BMP-2的鼠肌母细胞修复小鼠胫骨缺损的可行性，寻求一种表达BMP2能力高、取材方便且对机体创伤小的细胞载体，以促进临床骨缺损和骨不连的愈合。1材料与方法11 材料5型腺病毒穿梭质粒载体pXCl、5型腺

12、病毒骨架质粒pBHGE3、腺病毒E1区转化的人胚胎肾细胞即293细胞(Microbix Biosystems，加拿大)；鼠抗BMP一2一抗、羊抗LacZ抗(Santa Cruz)；DMSO、EDTA、茜素红、多聚甲醛DMEM、MEM培养基(Gibco)，DMSODEPC、鼠抗羊IgG、羊抗鼠IgG(北京中山试剂公司)；小鼠抗型胶原多抗、小鼠抗碱性磷酸酶多抗(Alexis)；DH5ct大肠杆菌、胎牛血清、小牛血清、羊抗BMP-2单克隆第一抗体(Gibco BRL)；蛋白酶K、RNA酶、dNTP Mix、DNA marker、AMV逆转录酶RNA酶抑制剂(Promega)；Taq聚合酶(上海申能博

13、彩生物技术公司)；内切酶EcoR I、Sal I(NEB)；重组腺病毒Ad-LacZ、C3H小鼠肌母细胞、转染AdBMP2的C3H小鼠肌母细胞、质粒pUCl9BMP2、腺病毒Ad5EGFP(复旦大学分子生物实验室)。12方法121 BMP-2重组腺病毒表达载体的构建：pUCl9BMP2用EcoR I和Sal I双酶切，将1 200 bp的酶切片段插入pDC315质粒中的酶切位点中，构建pDC315-BMP-2病毒载体。将质粒pDC315一BMP一2和腺病毒骨架质粒pBGHE3共转染至293细胞，通过同源重组的方法获得病毒。共转染914 d后出现病毒空斑，经3次病毒空斑纯化，得到表达BMP-2的

14、重组腺病毒。采用PCR方法对重组病毒和野生型腺病毒进行鉴定，正确克隆后命名为AdBMP2。病毒扩增后，50组织培养感染剂量法(median tissue culture infective dose，TCID50)测定病毒滴度。122鼠肌母细胞的分离和孵育：80只6周龄C3H小鼠，动物生产许可证号：SCXK(沪)2007-0002；使用许可证号：SYXK(沪)2004-0017。活体解剖小鼠的腓肠肌，取13 g肌肉组织研碎成糊状，在37含有型胶原蛋白酶、中心蛋白酶和胰蛋白酶的溶液中水解l h。将该细胞悬液离心后放入装有生长液且表面覆盖胶原蛋白的烧瓶中孵育7 d，再次离心细胞悬液，重复上述步骤1

15、次，得到肌母细胞。细胞用红细胞计数仪计数后，接种于24孔板上(每孔接种3105个细胞)，每天取3孔细胞用胰蛋白酶消化，中和胰蛋白酶，吹打重悬，台酚蓝染色，红细胞计数板计数活细胞，计数3次，取平均值为该时点的细胞数，描记细胞生长曲线。123 AdBMP2质粒转染肌母细胞：将510个肌母细胞置于2 mL含有上述AdBMP2质粒(2371010 pfu)的37溶液中，孵育后得到阳性载体细胞。将空白肌母细胞分别种植于三盘含DMEM液的培养板上(50105：fL)，培养24 h。用感染倍数(multiplicity of infection，MOI)=50的AdBMP-2和Ad-LacZ作用于其中两盘细

16、胞1 h，另一盘仍为空白肌母细胞。间接免疫荧光法测定BMP-2阳性细胞的数量：转染过夜并固定后使用抗BMP2的单克隆抗体液作用l h，分别用荧光标记的羊抗鼠IgG抗体液染色后荧光显微镜观察。碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)法测定细胞ALP活性：转染第7、9、1l、13 d收集各组细胞，每次各组均取8孔，细胞溶解后各取1 mL，用4一硝基苯酚磷酸盐法检测细胞溶解物中ALP含量。124 建立动物模型和分组：依次将各组目的细胞转入20个直径10 cm、厚05 cm的胶原海绵中，相应分为两组，每个胶原海绵中的细胞数量为10105。将浓度为2106mL的AdBMP-2、AdL

17、acZ转染的鼠肌母细胞和空白C3H鼠肌母细胞用PBS稀释，隔夜后用胰酶消化重悬，培养基调整细胞浓度达到l105mL。80只C3H小鼠分为4组(n=20)，以胶原海绵为支架将移植物植入小鼠胫骨近端骨缺损，分别为AdBMP一2转染组、AdLacZ转染组、空白组和AdBMP一2(等剂量)植入组。手术操作：小鼠取仰卧位四肢固定，取胫骨前内侧中上段切口，暴露胫骨后用组织剪剪除胫骨近端部分骨质，用不锈钢针固定胫骨两端骨质并造成5 ITlm骨缺损，材料植入缺损处并紧密结合，明胶海绵压迫止血，逐层缝合。术后分笼饲养。术后第3、6、9周，每组各选lO只小鼠取左侧骨缺损部位组织固定24 h，骨样组织经脱钙处理。依

18、次石蜡切片HE染色、光镜观察组织学形态及yon Kossa染色处理。动物模型制备后第3周，每周连续3次动物乙醚麻醉后以植入部位为中心投照左后肢，CT观察骨缺损修复情况，并于第3、6、9周每组随机取10只小鼠，进行植入区CT成像观察。1。3统计学处理采用SPSS ll。0软件进行统计学分析，计量资料用is表示。对AdBMP-2转染组、Ad-LacZ转染组和空白组细胞7、9、1l、13 d的ALP万方数据N。2 焦鲲等：腺病毒介导的骨形态发生蛋白一2基因治疗骨缺损的研究活性采用多样本均数两两比较q检验。P005)。表明构建的AdBMP2质粒转染后的鼠肌母细胞向成骨细胞分化，可有效表达具有生物活性的

19、BMP-2蛋白。26 AdBMP-2转染组骨缺损后的组织学表现术后第3周，AdBMP2转染组和Ad-BMP-2植人组脱钙的骨样组织中可见一些肥大软骨细胞和小片纤维组织中的骨形成、材料周围大量间充质细胞和血管形成、少许散在新生软骨细胞团和软骨基质。第6周，AdBMP一2转染组肥大的软骨细胞增生明显，骨万方数据上海交通大学学报(医学版)细胞分泌基质功能活跃，可见部分编织骨及板层骨纵带；Ad-BMP一2植入组可见软骨岛分布于植入物内，但周围有单核细胞及炎症浸润，骨小梁形成活跃，有大量不成熟的纤细网状编织骨，较AdBMP2转染组纤细、稀疏。第9周，AdBMP-2转染组的编织骨和板层状骨融合成片，可见骨

20、小梁被吸收，骨塑形不完全；AdBMP2植入组可见成熟板层骨，但薄且较稀疏，未完成骨塑形(图5)。VOR Kossa染色，仅AdBMP2转染组第6、9周可见中间有银染的成骨区(图6)。襄I 三组细胞ALP活性比较(i 4-s，UL)Tab 1 Comparison of ALP activity among cells of three groups(ij，UL)p0Ol w AdBMP-2 transfection group图5骨缺损部位的组织学表现HE染色Fig 5 Histological findings of bone defect HE stainingA：AdBMP-2 tran

21、sfection group；B：Ad-BMP-2 implantation group；1：the third week40；2：the sixth week x 100；3：the ninth week x 100行植入区CT成像观察。第3周末，AdBMP2转染组骨折断端周围可见高密度影和少许骨痂影，提示新骨形成。第6周末，Ad-BMP-2转染组骨折断端周围有大量骨痂影，骨缺损明显减小，骨痂占骨折处50，且一侧断端出现桥接，提示新骨形成；AdBMP2植入组骨折断端周围亦有大量骨痂影，骨缺损减小，骨痂占骨折处25，无断端桥田6 AdBMP-2转染组第9周时骨缺损部位的组织学裹现”“ 接，提示

22、新骨形成。第9周末，AdBMP2转染组K“8染色。100 骨缺损完全消失，并有高亮区骨化灶形成，但骨折F19 6 H咖。og矗nd佃98 of 6仰2 d。feeof Ao-BMP2。8“8扎。u。n 断端无髓腔出现；AdBMP-2植入组骨缺损亦完全87。”p 1n“。咖m”。k”“K。888 8删“i“8。100 消失，但无高亮区骨化灶形成，骨折周围骨质疏27 AdBMP2转染组骨缺损后的CT影像学变 松，亦无髓腔出现(图7、8)。AdLacZ转染组和空化 按既定时间点每次每组随机取10只小鼠，进 白组小鼠CT图像在第3、6、9周时未见明显改变。万方数据No2 焦 鲲，等：腺病毒介导的骨形态

23、发生蛋白一2基因治疗骨缺损的研究图7 Ad-BMP-2转染组植入区CT影像学变化Fig 7 Changes of CT findings in the performance area of Ad-BMP-2 transfection groupABC：the third，sixth and ninth week田5 AO。剧vlr-上强人殂租人区Ll彰像罕，监化Fig 8 Changes of CT findings in the performance am of AdBMP-2hnplantation groupA：the sixth week：B：the ninth week3讨 论B

24、MP2具有很强的诱导成骨潜能细胞向成骨细胞分化的能力，即诱导成骨作用。BMP2的成骨能力依赖于它在机体局部长期维持于较高的效量。单纯注入单剂量的BMP-2，因机体的降解、稀释或BMP-2在局部半衰期过短等因素，使其不能维持有效浓度，限制了它的直接运用。，所以BMP-2常需与载体复合才能更好地发挥作用。BMP2在目前应用的载体中易迅速释放、降解，而既往使用载体(如胶原海绵、羟基磷灰石等)均有移植后宿主排异反应等现象发生”J，因此，寻求合适的BMP-2载体已成为研究的关键。基因转染载体分为非病毒载体和病毒载体两大类，目前以逆转录病毒和腺病毒较为常用。把BMP7基因克隆至逆转录病毒可长期表达BMP-

25、7蛋白，并可用于骨修复。Engstrand等1用重组BMP2逆转录病毒转染小鼠成骨前体细胞植入远系小鼠能形成异位骨。但因该载体把外源基因整合到细胞的基因组上，且只能转染活跃分裂的细胞，有导致肿瘤发生可能；其长期表达BMPs蛋白亦可能引起长时间过度表达的并发症。以复制缺陷型腺病毒为载体，把外源基因转染进入活体细胞，后者不整合到基因组中转染效率高，能较长时问表达外源基因，表达时间可能与成骨所需时间吻合，是BMP-2等成骨诱导因子的良好表达载体1。腺病毒载体的DNA不与宿主细胞基因组整合，高效表达目的基因的最长时间可达23个月，完全能满足成骨需要；而且因为转染的基因无复制能力，其表达强度随着细胞分裂

26、而逐渐降低，不会出现长期分泌和过度表达的并发症。因此，本实验选择重组腺病毒为BMP2转染的载体并构建成功，且在体外高容量扩增病毒。有研究表明在骨骼肌细胞中存在少量可诱导的肌母细胞，在BMP2作用下能参与成骨，而且有许多研究驯集中致力于运用干细胞样的肌细胞治疗肌肉相关的疾病(如Duchenne肌萎缩)，但研究其在成骨方面价值的还不多。肌肉组织作为骨组织工程种子细胞有很多优点：来源于丰富的肌肉组织，取材方便；可重复进行而不损害患者的健康；肌母细胞对体外操作受性好；便于扩增。我们采用“预划平板(pre-plating)”技术成功地从小鼠腓肠肌中分离并孵育了纯度较高的肌母细胞。近来，利用基因转移技术对

27、种子细胞进行修饰后用于组织工程化骨组织的构建，使之既能发挥种子细胞的作用，又可在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子，从而提供了一种全新的技术手段。因此，本研究选择肌母细胞作为AdBMP2的载体。将该细胞载体转移到机体后，在机体局部持续分泌有效量的BMP-2，通过自分泌或旁分泌作用成骨叽。本实验通过描绘三组细胞的ALP活性曲线并进行统计学分析，发现所构建的AdBMP2质粒转染后的鼠肌母细胞向成骨细胞分化，可以有效表达具有万方数据上海交通大学学报(医学版)生物活性的BMP2蛋白；同时，组织切片和cT结果提示，AdBMP-2转染组在第9周末骨缺损已完全消失，并有高亮区骨化灶形成。所以以鼠肌母

28、细胞为载体、胶原海绵为支架，运用AdBMP2质粒可以在小鼠胫骨缺损区短期有效成骨，为基因诱导成骨治疗提供了一种新的、可靠载体细胞的来源。骨骼肌是骨科医师真正可获取的大量骨母细胞的来源，且肌母细胞已成功地用于成肌细胞移植和其他基因治疗。因此，它可能成为基因工程人工骨的种子细胞。本研究把Qu等21的方法进行改进，从免疫力正常的c3H小鼠腓肠肌中分离出鼠肌母细胞，用重组腺病毒转染后，免疫细胞化学染色显示这些细胞表达ALP和I型胶原，表明它们向成骨细胞样细胞分化，提示骨骼肌细胞可作为基因工程人工骨的体外转染细胞。我们用基因工程技术将诱导成骨作用较强的BMP-2基因转入来源丰富且扩增迅速的鼠肌母细胞中，

29、在体外分泌具有生物活性的BMP2蛋白，通过持续表达BMP一2并诱导自身分化为成骨细胞样细胞，这表明鼠肌母细胞是骨组织工程和基因治疗可选用的种子细胞，用重组BMP-2腺病毒转染鼠肌母细胞植入骨缺损并加以修复是可行的，为基因工程方法构建人工骨提供了表达成骨诱导因子的新载体。总之，骨骼肌中的肌母细胞是可诱导骨母细胞的一种非常重要的来源，未来在扩增和分离肌母细胞方面的发展将会极大地促进其应用于骨缺损修复。本实验为应用于临床治疗骨缺损和坏死疾患提供了理论依据。参考文献：1Lieberman JR，Le LQ，Wu L，et a1Regional gene therapy with aBMP-2一prod

30、ucing marine stromal cell line induces heterotopic andorthotopic bone formation in rodentsJJ Orthop Res，1998，16(3)：3303392Robbins PD，Ghivizzani SCviral vectors for gene therapyJPhar-macol Ther1998，80(1)：35473Lieberman JR，Le LQ，Wu L，et a1Regional gene therapy with aBMP-2 producing stromal cell line i

31、nduces heterotopic and orthotopicbone formation in rodentsJJ Orthop Res，1998，16(3)：3303394Breitbart AS，Gfande DA，Mason JM，et a1Gene enhanced tissueengineering：application for bone healing using cultured periostealcells transduced retrovirually with the BMP7 geneJAnn PlastSurg1999，42(50)：4884955Engst

32、rand T，Daluiski A，Bahamonde ME，et a1Transient produc-tion of bone morphogenetic protein-2 by allogeneic transplantedtransduced cells induces bone formationJHum Gene Ther，2000，11(1)：2052116Alden TD，Pittman DD，Hankins GR，et a1In vivo endochondrslbone formation using a bone morphogenetic protein-2 aden

33、ovirslvectorJHum Gene Ther1999，10(13)：22452253【7Khouri RK，Brown DM，Koudsi B，et a1Repair of calvarialdefects wity flap tissue：role of bone morphogenetic proteins andcompetent responding tissuesJPlast Reconstr Surg，l 996。98：(1)103一1098Gussoni E，Soneoka Y。Strickland CD，et a1Dystrophin expressionin the

34、mdx mouse restored by stem cell transplantationJNature，1999，401(6751)：390394【9Qu Z，Huard JMatching host muscle and donor myoblasts for myo-sin heavy chain improves myoblast transfer therapyJGene Ther，2000，7(5)：42843710Musgrave DSt Pruchnic R，wright V，et a1The effect of bonemorphogenetic protein-2 ex

35、pression on the early fate of skeletalmusclederived cellsJBone。2001，28(5)：49950611Lee JY，Peng H，Usas A，et a1Enhancement of healing based onex vivo gene therapy using human musclederived cells expressingbone morphogenetic protein 2JHum Gene Therapy，2002，13(10)：120112111 2Qu Z，Balkir L，van Deutekom jc，et a1Development of approachesto improve cell survival in myoblast transfer therapyJJ Cell Biol。1998142(5)：12571267收稿日期：20080604 本文编辑：周珠凤万方数据