六味地黄丸微生物限度检查检验方法验证方案设计(2022年版).docx

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1、六味地黄丸微生物限度检查检验方法验证方案设计(2022年版) 标准文档 1.概述 1.1六味地黄丸（浓缩丸）是中国药典品种，批准文号：国药准字Z42022681，其处方由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻组成，具有滋阴补肾之功效，用于肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴。有效期：36个月。 1.2根据剂型与产品处方判断，六味地黄丸（浓缩丸）的微生物限度检查容应包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，以及大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌检查；根据六味地黄丸（浓缩丸）的成分和历史验证数据分析，该产品无明显的抑菌活性，拟采用“平皿法”进行微生物限度检查，采用“常规法”进行控制菌

2、检查。 2.目的 确认所采用的方法适用于该产品的微生物计数，以确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确可靠。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。 3.依据 中国药典2022年版四部“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”、“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、“非无菌产品微生物限度标准”。 4.围 本验证方案适用于公司六味地黄丸微生物限度检查检验方法的适用性试验。 5.职责 5.1验证领导小组 5.1.1负责验证方案的审批。 5.1.2负责验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施。 5.1.3负责验证数据及结果的审核。 5.1.4负责验证

3、报告的审批。 5.1.5负责发放验证证书。 5.2质量部 5.2.1负责验证所需的培养基、样品、菌液、缓冲液等的准备。 5.2.2负责取样及对样品的检验。 5.3项目验证小组 5.3.1负责拟订验证方案。 5.3.2负责验证方案的实施和收集各项验证试验记录，并对试验结果进行分析后，起草验证报告，报验证领导小组。 6.验证实施条件 6.1验证方案培训：在验证实施前，应对参与验证的人员进行验证方案以及与验证相关的文件进行培训，确保相关人员掌握了验证的相关要求与知识。 6.2微生物限度检测室：检验所使用的检测室应经过HVAC系统确认，并符合要 求。 6.3检验用水：验证过程使用的纯化水其制备系统应经

4、过确认并符合要求，纯化水质量应经过检验并符合中国药典2022年版二部的要求。 6.4检验仪器设备：验证涉及的检验仪器（设备）与检验方法，应经过技术监督局校验合格或者公司确认/验证合格。 6.5培养基：验证所使用的培养基应经过培养基的适用性检查，其结果符合中国药典的相关要求。见附件2:培养基确认。 6.6验证菌种：验证所使用的菌种，其种类与传代次数应符合中国药典的相关要求。菌种情况见附件3:菌种确认。 7.合格标准 7.1在需氧菌、霉菌及酵母菌计数的三次独立平行试验中，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.52围。 7.2在控制菌检查的试验中试验组应检出试验菌，阳

5、性对照组应检出试验菌，阴性对照组不得检出试验菌。 8.验证方法 8.1菌液制备： 8.1.1取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物各1ml,分别加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释至10-5-10-7。取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。 8.1.2取1ml上述制备的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、

6、黑曲霉菌菌液分别注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 8.1.3、取1ml上述制备白色念珠菌、黑曲霉菌液注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 8.1.4结果：见附件4:菌液浓度确定。 8.2需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验 8.2.1供试液制备：称取供试品10g,用胰酪大豆胨液体培养基稀释至100ml，用匀浆仪等适宜的方法混匀，制成1:10供试液。 8.2.2试验组：吸取1:10的供试液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的试验菌 题目 六味地黄丸微生物限度检查方法 适用性试验

7、验证方案 页码3/15编号SOP-YZ-6204版本号 B 修改状态0 悬液后摇匀。 8.2.3菌液对照品：吸取稀释液胰酪大豆胨液体培养基9.9ml，共5份，每份中加入与试验组相同的菌悬液后摇匀。 8.2.4试验组和菌液对照组摇匀后，分别从所有试验菌试管中吸取1ml注入直径90mm的平皿中，倾注胰酪大豆胨固体培养基；另分别吸取白色念珠菌1ml注入直径90mm的平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基；平行2份。 8.2.5供试品对照组：吸取1:10的供试液1ml注入直径90mm的平皿中，平行四份，其中两个平皿中注入胰酪大豆胨琼脂培养基，另两个注入沙氏葡萄糖琼脂培养基，摇匀。 题 目 六味地黄丸微生物限

8、度检查方法 适用性试验验证方案 页码 4/15 编 号 SOP-YZ-6204 版本号 B 修改状态 0 8.2.6将以上平皿分别置3035或2025培养，需氧菌培养不超过3天，真菌培养不超过5天，在3天和5天分别进行计数。 8.2.7 计算公式： 8.2.8试验结果： 8.2.8.1见附件5:需氧菌总数计数方法适用性检查结果 8.2.8.2附件6:霉菌和酵母菌总数计数方法适用性检查结果 8.3控制菌检查 8.3.1大肠埃希菌 8.3.1.1供试液制备：同“需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验”供试液制备。 8.3.1.2试验组：取1：10供试液10ml 和100cfu 大肠埃希菌菌液加入100ml 25.0-=-菌液对照组菌落数 供试品对照组菌落数试验组菌落数