腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用.pdf

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1、综 述DOI: 10. 3760/ cma. j. issn. 1673- 436X. 2015. 09. 018作者单位: 210002南方医科大学南京临床医学院(南京军区南京总医院)呼吸科通信作者:施毅, Email: shiyi56 126. com腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用刘志成 施毅【摘要】 腺病毒载体因具有高滴度、转染效率高、可转染至非分裂期及分裂期细胞、给药途径多等优点,广泛应用于疾病的基因治疗。呼吸系统疾病是一类严重影响人类生命健康的疾病,近年来关于呼吸系统疾病基因治疗的研究引起了国内外学者的关注。现对腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用作一综述。【关键词】

2、腺病毒科;呼吸系统疾病;基因治疗Application of adenovirus vector in the gene therapy of respiratory disease Liu Zhicheng , Shi Yi .Department of Respiratory M edicine , Nanjing General Hospital of Nanjing M ilitary Command ,Clinical College of Southern M edical University , Nanjing 210002 , ChinaCorresponding autho

3、r : Shi Yi , Email: shiyi56 126 . com【 Abstract】 Because adenovirus vector has high titer, the advantages of high transfection efficiency,ability to transfected to non- dividing and dividing cells, multiple routes of administration, it is widely usedin gene therapy. Respiratory disease is a type of

4、serious diseases affecting human life and health. Recentresearch on gene therapy for respiratory diseases caused concern of domestic and foreign scholars. Theapplication of adenovirus vector in gene therapy of respiratory diseases is summarized.【 Key words】 Adenoviridae; Respiratory diseases; Gene t

5、herapy随着许多关于基因治疗的动物研究及临床试验研究成功开展,使得基因治疗在疾病治疗方面的应用越来越受到重视 1 。目前基因治疗的载体主要包括病毒载体和非病毒载体,病毒载体比非病毒载体转染效率高。腺病毒载体又由于具有可以转染非分裂期细胞,遗传毒性低,对肺组织具有亲嗜性等优点 2 ,广泛应用于呼吸系统疾病基因治疗的研究。1 腺病毒载体的发展腺病毒( adenovirus, Ad)是一无包膜的双链DNA病毒,由外表面的蛋白质外壳及内部的蛋白核酸复合物组成。其中蛋白质外壳由252种壳粒组成,包括240个六邻体和12个五邻体组成。每个五邻体上都有一个纤维突起,纤维上带有主要的种属特异性抗原决定族,

6、主要结合细胞表面柯萨奇/腺病毒受体( coxsackie adenovirus receptor, CAR) ,参与病毒感染细胞过程。腺病毒基因组的长度约为36 kb,基因组两端各有长100 150 bp的末端反向重复序列( invertedterminal repeats sequence, ITRs) ,在其左端的ITRs 3端为长约300 bp的包装信号,它们分别是腺病毒复制及包装所必需的顺式作用元件。根据病毒DNA复制前后顺序,可将基因分为早期和后期转录单元,早期基因可分为E1a、 E1b、E2a、 E2b、 E3和E4,编码病毒的调节蛋白;后期基因由L1L5组成,编码病毒的结构蛋白。

7、由于腺病毒在感染宿主细胞时,其基因并不插入宿主基因,从而减少了宿主细胞发生基因突变的风险。目前人们对腺病毒载体引起机体免疫反应的机制了解甚少。病毒蛋白、目的基因产物都可能诱发免疫反应。研究还发现强大的外源启动子(如现在普遍采用的CM V启动子) 3及病毒相关的RNA 4都可以诱发机体炎症反应。机体产生免疫反应后,将会影响目的基因产物的生成以及造成机体免疫损伤。腺病毒作为基因治疗的载体,需要对其进行改造,使其能够插入更多的目的基因,同时尽可能地减少病毒蛋白的产生。为了使腺病毒载体更好的表达目的基因,有学者 5构建了一种特殊的腺病毒载体,他们将腺病毒载体包含在阴离子脂质体中,在阴离子脂质体表面插入

8、叶酸,使其能够与支气管上皮细胞受体结合,这种复合体相对于普通腺病毒载体能够显著增强基因转染效率。另外, Beckett等 6报道通过事先给予小鼠吸入雾化的全氟溴烷能够增强腺病毒载体在气道上皮细胞中目的基因的表达。根据腺病毒载体缺失病毒基因组不同,可将腺病毒载体分为三代。第一代腺病毒载体通过去除腺病毒基因组的E1和/或E3两个区而获得。克隆容量约7. 5 kb。 E1基因为病毒复制必需区,其缺失可使腺病毒载体成为复制缺陷型。但在实际上,许多细胞能够产生一些蛋白去促进病毒晚期结构蛋白的转录,从而诱发免疫反应。由于第一代腺病毒载体拥有病毒滴度高,感染效率高,制备简单等优点,使其在基因治317国际呼吸

9、杂志2015年5月第35卷第9期 Int J Respir, M ay 2015, Vol. 35, No. 9疗中得以广泛应用 2 。第二代腺病毒载体是在第一代的基础上进一步缺失E2/ E4区,使得允许插入最大约14 kb的外源序列,并进一步降低了病毒蛋白的表达。但基因转移和表达时间没有明显延长,且病毒载体滴度很低,只有第一代的1/ 1 000 1/ 10,因此没有在研究中广泛应用 2 。第三代腺病毒载体去除了病毒所有结构基因,仅保留反向末端重复序列和包装信号,其可容纳的外源基因达36 kb,最大程度减少了病毒蛋白的产生。上述三代腺病毒载体在制备过程中均需要外源细胞等提供产生重组病毒所需的蛋

10、白及基因。其中第三代腺病毒载体由于需要辅助病毒参与才能制备,又被称为辅助病毒依赖性腺病毒载体( helper dependentadenoviral vector, HdAd) 7 。2 腺病毒载体投送至肺部的途径人们在鼠类实验研究中发现,对于支气管及肺泡上皮细胞来说,腺病毒载体是有效的基因治疗载体,它主要在支气管肺泡区域引起显著的目的基因表达 8 。腺病毒载体投送至肺部主要有下面4种途径。 经鼻滴入:其主要优点是对小鼠创伤小,操作简单。通过使小鼠被迫经鼻呼吸及麻醉状态气道纤毛运动受限,增加进入肺内的病毒量。但病毒存在丢失,包括咽喉部位的丢失,甚至误入食道,投送效率较低,无法准确判断进入肺部病

11、毒的量。经口气管插管:相对于滴鼻,其减少了病毒的丢失,投送效率高。但在小鼠,很难在肉眼下行插管。有文献介绍借助喉镜等一些设备辅助插管。 Bivas- Benita等 9利用M icroSprayereaerosolizer介绍了一种无创气管插管的方法,对小鼠的损伤小,且药物投送效率高。 经气管途径:此种方法需要手术,对动物的损伤大,且动物一次耐受病毒的量有限,但其投送效率最高。 雾化吸入:需要使用雾化器将腺病毒载体雾化,由雾化病毒颗粒的大小、速率等决定其在气道中的沉积部位。这种方法对机体损伤最小,但存在对病毒载体原料消耗大,无法准确预计达到肺部沉积的最佳用量等问题 10 。3 腺病毒载体在呼吸

12、系统疾病中的应用3. 1 感染性疾病 细胞因子及趋化因子等免疫活性因子在肺部感染的基因治疗中显示了良好的前景。 Shao等 11构建了干扰素 ( interferon- , IFN- )腺病毒载体( Ad- IFN- ) ,经鼻滴入小鼠肺部, 2 d后经鼻给予小鼠5 107曲霉孢子,以给予Ad- EGFP及生理盐水作为对照组。结果发现,对照组的大部分小鼠在感染后96 h死亡,实验组小鼠的生存率较对照增加3倍。感染后第2天收集实验组小鼠肺组织匀浆发现, IFN- 及IL- 12水平较对照增加4倍。肺组织六胺银( gomori methenamine silver, GM S)染色发现,相对于对照

13、组,实验组小鼠真菌负荷减少了75% ,肺组织细胞坏死及炎性渗出也明显减少。这些数据都证明在给予Ad- IFN- 后,小鼠抵抗曲霉感染的能力得到了增强。 Shao等发现在给予小鼠Ad- IFN- 后,小鼠肺泡灌洗液和肺组织中IFN- 水平呈时间和剂量依赖。病毒量在5 108 pfu时, IFN- 水平最佳,并避免了小鼠嗜睡、体质量减轻等全身反应的发生。同时Shao等在小鼠腹腔注射Ad- IFN- 后,并没有发现肺部灌洗液中IFN- 水平的升高,也没有增加小鼠曲霉感染后的生存率,说明局部给予腺病毒载体能够有效增加其在肺内的作用。 Kumaki等 12构建了mIFN- 腺病毒载体( Ad- mIFN

14、- ) ,也通过经鼻滴入的方式使其进入小鼠肺部。发现其能够保护SARS冠状病毒感染的小鼠,提高小鼠生存率,并改善其肺组织炎症,并且该作用也具有剂量依赖性。 Steinwede等 8构建了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( granulocyte-macrophage colony- stimulating factor, GM - CSF)腺病毒载体( Ad- GM - CSF) ,并经气道转染小鼠,在2 4周后再给予小鼠致死剂量的肺炎链球菌。结果发现Ad- GM - CSF转染能够显著降低小鼠死亡率。研究中还发现肺部高表达GM - CSF后,肺炎链球菌引起的白细胞募集由以中性粒细胞为主转变为以巨

15、噬细胞为主。这种改变使得促炎症细胞因子及趋化因子的释放减少,减少了巨噬细胞的凋亡和坏死,从而减少了肺部间质性炎症和中性粒细胞渗出引起的肺泡炎。在其他学者的研究中也发现了同样的现象,但这种转变的具体意义尚需进一步研究。 Francisco- Cruz等 13发现在结核分枝杆菌感染1 d前通过气管内给予Ad- GM - CSF,能够增强小鼠抵抗结核菌的能力。相对给予空病毒载体组,Ad- GM - CSF组能够显著减少肺组织结核杆菌负荷;在肺组织病理中发现肺部炎症区域缩小,肉芽肿区域增加,肉芽肿也增大;活化的树突状细胞显著增加; GM - CSF、 IFN- 、肿瘤坏死因子 ( tumor necr

16、osis factor- , TNF- ) 、 IL- 12、诱生型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达水平显著增加。还有研究通过构建免疫应答通路中重要蛋白的重组腺病毒载体,发现其也能增加小鼠抗击病原体的能力 14 。3. 2 肺癌 REIC/ Dkk- 3蛋白最初在永生化细胞系中发现,是肿瘤的抑制蛋白, REIC/ Dkk- 3在许多人的永生细胞及肿瘤细胞中表达下调 15 。 Shien等 16构建了Ad- REIC,在体内及体外实验中均证实Ad- REIC对于非小细胞肺癌具有治疗意义。同时发现其疗效与肿瘤细胞是否表达GRP78和C

17、AR相关。作者根据GRP78及CAR表达水平的不同,将细胞系分为3类, A类为GRP78低表达, CAR高表达; B类为两者全部高表达或低表达; C类为GRP78高表达, CAR低表达。对于A类细胞, Ad- REIC的治疗有效率为100% ,B类细胞为42% , C类细胞为0。进一步研究其作用机制发现, Ad- REIC是通过REIC/ Dkk- 3蛋白诱导肿瘤细胞凋亡,但Ad- REIC并不能特异性识别肿瘤细胞。有研究发现,Ad- REIC感染人正常成纤维细胞后,并没有导致人正常成纤维细胞的凋亡,而是促进了IL- 7产生 17 ,这提示Ad- REIC存在非直接的抗肿瘤作用,可以通过IL-

18、 7加强抗肿瘤免疫。在日本和美国已开始进行Ad- REIC用于治疗前列腺癌的临床研究试验( NCT01197209) 。 Ad- REIC应用于非小细胞肺癌具有良好的治疗前景。若将Ad- REIC用于治疗非小细胞肺癌,不需要考虑肿瘤细胞是否存在已知的分子结构改变,或是否表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂敏感。Keedy等 18报道了Ad- p53治疗支气管肺泡癌的I期临床研究。该试验的主要目的是研究Ad- p53应用于临床的安全性,仅对一处病变肺段进行治疗。通过支气管肺泡灌洗给417国际呼吸杂志2015年5月第35卷第9期 Int J Respir, M ay 2015, Vol. 35, No

19、. 9予Ad- p53,开始病毒剂量为每次2 109 vp,病毒剂量呈10倍递增。每个剂量组行纤维支气管镜灌洗2次,每隔1周进行1次灌洗。如患者能够较好的耐受则反复给予重组腺病毒载体,患者获得了临床改善并且无明显毒性反应则可进入下一剂量,最常见的不良反应是短暂的咳嗽及呼吸困难加重。最后根据患者的耐受情况,最终决定给予病毒剂量为5 1011 vp。该研究发现在患者的尿液、血液中几乎检测不到病毒,且在一些患者纤支镜活检组织中发现p53mRNA表达。证明药物主要在给予治疗部位发挥作用。在23例接受疗效评价的患者中,有16例患者病情稳定, 7例患者病情进展, 1例患者疗效结果不详。大部分患者表示呼吸系

20、统症状较前改善。这项研究提示可以通过纤支镜进行肺灌洗的方式给予重组腺病毒,拓展了局部基因治疗的应用范围。另外, Antonia等 19发现在给予p53腺病毒载体疫苗后,能够逆转广泛期小细胞肺癌患者化疗耐药,使耐药的小细胞肺癌患者接下来化疗的临床有效率达61. 9% ,这提示联合基因治疗和化疗具有良好的应用前景。还有相关的临床试验通过胸腔内注入重组腺病毒载体以增强机体抗肿瘤免疫功能,用于治疗恶性间皮瘤及恶性胸腔积液,均显示了良好的疗效和应用价值 20 。3. 3 肺纤维化 众所周知,转化生长因子 ( transforminggrowth factor- , TGF- )信号通路在肺纤维化病理进程

21、中起到重要作用, Sama3能够将TGF- 信号从细胞膜传递到胞核。 Zhao等 21发现Sama3敲除小鼠能够减轻博来霉素诱导的肺纤维化。 Dong等 22应用RNA干扰技术,沉默Sama3表达。他们利用针对Sama3基因的shRNAs,构建了重组腺病毒载体,然后将载体通过气道投送到小鼠肺部,结果发现小鼠肺组织中Sama3的mRNA及蛋白水平均降低,并且能够抵抗博来霉素诱导的肺纤维化。 Sakamoto等 23发现在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化中,角质细胞生长因子( keratinocyte growth factor, KGF)表达水平下降。于是,他们构建了Ad- KGF,并将其通过气道注入

22、小鼠肺内,结果发现,相对于对照组,给予Ad- KGF后肺组织KGFmRNA显著增高,同时伴有肺泡上皮细胞增生,肺顺应性增加,死亡率下降。提示Ad- KGF对肺纤维化具有治疗意义。3. 4 其他肺部疾病 囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传病,由于囊性纤维化跨膜调节蛋白( cystic fibrosistransmembrane regulator, CFTR)基因突变所导致。很早就有研究者利用腺病毒载体去治疗这一类疾病,但是由于机体对重组腺病毒载体存在免疫反应、囊性纤维化局部黏液大量分泌及严重炎症反应等影响了目的基因的表达,使其得临床疗效欠佳 24 。 Cao等 25构建了带有人CFTR基因的辅助

23、病毒依赖性腺病毒载体( HdAd- hCFTR) ,借助纤维支气管镜通过雾化的形式投送至猪的气道内,实验发现猪能够较好耐受HdAd- hCFTR。通过免疫荧光技术发现目的基因能够有效地在气道上皮细胞中广泛表达,黏膜下腺体也发现了大量目的基因的表达,并且发现目的蛋白定位于细胞膜。这项研究为HdAd在囊性纤维化的基因治疗中的作用提供了重要依据。 Nagai等 26发现在囊性纤维化的基因治疗中,通过服用丙戊酸能够增强呼吸道上皮细胞转染效率并减轻机体炎症反应,其机制可能为丙戊酸钠能够增强调节性T细胞的活性。许多研究已经证实,细胞因子在哮喘及COPD的持续性炎症反应的发生中发挥重要作用 27 。 Hsu

24、等 28构建了Ad- IL- 12和Ad- IL- 10,发现将其同时投送到哮喘小鼠模型后,相对于单用一种重组腺病毒载体,能够更有效地减少气道高反应性的发生,及减轻IL- 12应用后引起的TNF- 介导的细胞炎症。联合应用Ad- IL- 12和Ad- IL- 10的情况下,肺泡灌洗液中IL- 4、 IL- 5及嗜酸粒细胞趋化因子等水平均显著下降。4 小结综上所述,由于腺病毒载体具有高转染率、不整合至宿主基因中,可减少插入突变的风险、安全性较高、能够快速高效表达目的基因且可转染非增殖细胞等优点,使其在肺部疾病基因治疗中得到了广泛应用,并取得了一些可喜的成绩。尤其在动物实验中,可以在组织、细胞、分

25、子等多水平研究疾病的变化情况,为研究疾病提供了有效手段。但同时,腺病毒载体也存在一些不足之处。如由于其引起免疫反应,不适于重复给药,造成目的基因表达时限较短,影响了其在临床中的广泛应用。同时腺病毒载体到达靶细胞部位并成功感染靶细胞也面临着重重障碍,如气道纤毛的运动,黏液屏障,免疫细胞,靶细胞的易感性等。随着对腺病毒载体作用机制及其影响因素不断地深入研究,为增加靶细胞目的基因表达及减少不良反应,人们对腺病毒载体进行着不断地改造和优化。相信在不久的将来,将会出现一批高效安全的腺病毒载体,既能够有效满足其治疗目的,同时也能够减少不良反应。从而为临床上尚不能有效治疗的疾病提供一个新的途径,腺病毒载体相

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