基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响.pdf

《基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响.pdf（5页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第17卷第12期2011年6月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeV0117，No12Jun，2011DOI：CNKI：113495R201104200932011药理基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响易华1，杜标炎，谭宇蕙1，刘爱军1，罗惠1，骆欢欢2，苏俊芳1，王慧峰1(1广州中医药大学基础医学院，广州 510006；2广州中医药大学新中医编辑部，广州 510405)【摘要 目的：探讨六味地黄丸联合基因治疗对小鼠移植性肝癌缝隙连接蛋白(connexin，cx)表达的

2、影响，初步阐明六味地黄丸对肝癌HSVtkGCV自杀基因治疗的增效作用机制是否与缝隙连接相关。方法：昆明种小鼠90只，随机分为模型对照组、六味地黄丸治疗组(ig六味地黄丸10 gkgd“)、自杀基因治疗组(ip丙氧鸟苷100 mgkgd“)，联合治疗组(ig六味地黄丸10 gkgd。+ip丙氧鸟苷100 mgkgd“)；选用H22与H22tk细胞株皮下接种建立小鼠肝癌模型，取荷瘤小鼠肿瘤组织进行常规病理制片，采用SABC免疫组化法检测各组肿瘤组织Cx26，Cx32，Cx43蛋白表达。结果：阳性表达定位于细胞浆和细胞膜，Cx43在癌旁组织，特别是有纤维组织浸润部位表达呈强阳性，而在癌结节中肿瘤细胞

3、表达相对较弱；Cx26，Cx32在肿瘤细胞特别是脂肪组织浸润附近的癌组织中呈现强阳性表达。与肿瘤模型组相比，联合治疗组则能增强Cx26，Cx43，Cx32蛋白表达，差异有统计学意义(P90；按10 mLkg一1 1 5万方数据第17卷第12期201 1年6月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeV0117，No12Jun，2011(含2106个肿瘤细胞)细胞悬液接种子小鼠的皮下。23分组及治疗昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组，模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组(自

4、杀基因联合六味地黄丸)，正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水10 mLkg，其他各组右前肢腋下接种等量肝癌细胞悬液。正常对照组和模型对照组第2一16天蒸馏水ig，25 mLkg，第616天ip生理盐水125 mLkg；六味地黄丸治疗组第2一16天六味地黄丸悬液ig每天25 mLkg一，小鼠给药剂量为生药10 gkg一d第616天ip生理盐水每天125 mLkg一；自杀基因治疗组第2一16天蒸馏水ig每天25 mLkg，第6一16天ip GCV每天125 mLkg；联合治疗组216天六味地黄丸悬液ig每天25mLkg一，小鼠给药剂量为生药10 gkg，第616天ip

5、 GCV每天125 mLkg。24肿瘤质量及抑瘤率实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，电子夭平称质量，计算抑瘤率。P抑=(mm塑蠼一，l治疗组)m模型组10025各组肿瘤组织缝隙连接蛋白表达251病理制片及免疫组化染色 取小鼠肿瘤组织，每组选取18个左右动物肿瘤组织，常规切片后，DAB免疫组化染色，具体方法按SABC试剂盒说明书进行。252免疫组化染色评价标准H1 实验结果判定以胞质内和胞膜上出现棕黄色颗粒为阳性，每例切片在4010显微镜下随机选取5个高倍视野计数，根据显色强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。按显色强度分为无色、黄色、棕黄色、棕黑色分别计为03分；按阳性细胞比倒分为0，

6、23，分别计为03分。将两项积分相乘，确定0分为阴性，13分为弱阳性，46分为中等阳性，79分为强阳性，分别计为一，+，+十，卅。阴性(一)，无染色信号；弱阳性(+)，染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50以下；中等阳性(+)，染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50以上；或染色信号呈粗颗粒状、块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50以下；强阳性(卅)，染色信号呈粗颗粒状或块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50以上。11626统计学处理数据应用SPSS 115统计软件分析，计量资料以元s表示，采用单因素方差分析；多组等级资料按Kruskalwalls Test法进行统计。P00

7、5有统计学意义。3 结果31肿瘤质量及抑瘤率 各组肿瘤质量及抑瘤率见表1。表1各组肿瘤质量注：与肿瘤模型组比较P005(表2同)。32镜下观察Cx26，Cx43，Cx32蛋白表达阳性表达定位于细胞浆和细胞膜，Cx43在癌旁组织，特别是有纤维组织浸润部位表达呈强阳性，而在癌结节中肿瘤细胞表达相对较弱；Cx26，Cx32在肿瘤细胞特别是脂肪组织浸润附近的癌组织中呈现强阳性表达。统计分析显示，与肿瘤模型组相比，联合自杀基因治疗组能增强Cx26，Cx43，Cx32蛋白表达，差异有统计学意义(P005)；与单独六味地黄丸治疗组和自杀基因组比较，联合组能增强Cx32蛋白表达，差异有统计学意义(P005，P

8、001)，结果见表24和图l一3。裹2各组肿瘤细胞袭达Cx26蛋白阳性等级评分 只组别 n 剂量gkg“ + H 卅肿瘤模型 18 9 8 1六味地黄丸 19 10 5 11 3自杀基因 18 01 6 10 2联合治疗 20 LDl0+GCVO1 1 10 92,3,4)注：与肿瘤模型组比较2P0Ol；与六味地黄丸组比较3P005；与自杀基因组比较4P001(表4同)。万方数据昌华，等基因治疗联合六味地黄丸砖肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响&4*目n$t ex43目*辞4# R目2m*mg cd2*&目*目R(SABC x 400 J4讨论自杀基因疗法因存在旁观者效应的独特机制而成为具有广

9、泛应用前景的肿瘤治疗新方法，其在理论上能完全治愈肿瘤。但体内单纯自杀基因治疗因转染率低，靶向性不够而难以达到这一目标，因而寻找肿瘤自杀基因疗法增效药物及途径成为肿瘤自杀基因治疗研究的热点，旁观者效应则成为增效作用研究的最重要的靶点。我们以六昧地黄丸对cx蛋白表达的影响与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的缝隙连接机制之内在联系为研究的切人点，比较了六目，m*目g cx43免噩目*目R(SABC x枷I味地黄丸联合自杀基因疗法治疗与单纯六味地黄丸治疗或单纯自杀基因治疗的抗肿瘤效果结果显示自杀基因疗法和六味地黄丸治疗抑瘤率与模型组比均无统计学意义，而联台治疗组显示了较好的疗效，提示单纯的中药并没有直接的抑

10、瘤作用，自杀基因疗法未见明显的疗效则是基于为联合治疗留下杀伤肿瘤空问控制了药物浓度。虽然自杀基因“旁观者效应”发生机制复杂，目前尚未完全阐明清楚，但GJIC介导的缝隙连接机制正受到越来越多学者的关注”。cx作为GJIC的物质基础，由其介导的GJIC与HSV-tkGCV自杀基因的旁观者效应密切相关”。cx家族共有13个成员，它们在体内的分布与GJIC通路有关。其中Cx26，Cx43和Cx32是与肝细胞密切相关的缝隙连接蛋白，由其组成的连接子在质膜上常成簇出现形成缝隙连接斑(gap Junction plaque)，其数量直接影响GJIC功能。大量研究发现“：细胞恶性转化后普遍存在cx表达缺陷和G

11、JIC功能缺陷，GJIC功能的缺陷使恶性化细胞逃离生长控制，在转移过程中逃避免疫监视，转移能力的强弱与GJIC呈负相关。Mesnil等”总结了GJIC在旁观者效应中的作用发现无论是体内还是体外，缝隙连接的表达高低与潜在的旁系伤作用之间具有直接的相关性，特别是在使用HSV-tkGCV作为为自杀基因系统的情况下更是如此。因此增加cx的表达量，或转导cx基因，或使用可增加cx功能的代谢化合物(如视黄醛或cAMP)均可提高自杀基因疗法的旁观者效应。中医药是一个伟大的宝库，目前已经证实三七总皂苷，白藜芦醇、姜黄索等多种中药有效成分可改善肝癌细胞GJlC功能，另有研究表明六味地黄丸可影响CAMP及IL-2

12、，TNFd等细胞嗣子的表达，而后者与cx的表达及GJIC关系密切，由此可推测六昧地黄117习万方数据第17卷第12期2011年6月中国实验方剂学杂志Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVo】17，No12Jun，2011丸增强肝癌HSVtkGCV旁观者效应的机制与增强Cx蛋白的表达有关。实验中发现GCV治疗组3种Cx蛋白的表达与肿瘤模型组水平差异不大，证实了虽然肿瘤细胞的缝隙连接表达异常，但自杀基因系统的旁观者效应仍然可以通过残存的缝隙连接发挥作用。而联合治疗组的3种Cx蛋白表达均高于肿瘤模型组。其可能性的机制

13、在于：肿瘤细胞在短时间被大量杀伤后，造成大量的组织间隙，从而为大量成熟缝隙连接在细胞问迁移和再组装创造良好条件。六味地黄丸可以诱导肿瘤细胞Cx表达和功能增强。体外研究发现cAMP、视黄酸、类胡萝卜索、类固醇激索及叶酸类物质通过诱导细胞Cx表达，可增强细胞GJ的功能o。而动物实验研究结果也表明0|，六味地黄汤可对抗环磷酰胺的诱变作用，增加子宫颈癌V14瘤细胞内的cAMP的含量，延长荷瘤小鼠的存活时间。各治疗组之间的比较中，联合治疗组能明显提高Cx32的表达，差异有统计学意义，而Cx26和Cx43的表达各组间差异无统计学意义，可能是因为Cx蛋白表达具有组织特异性。以上结果提示六味地黄丸可能是通过增

14、加细胞内cAMP的含量或者其他细胞因子及可溶性因子从而间接增强cx蛋白的表达，促进邢弘iGCV系统治疗小鼠肝癌中缝隙连接机制的效应，具体机制有待进一步研究。此外，在前期工作中我们对各组肿瘤组织的病理检查发现联合治疗组肿瘤细胞密度相对较低，肿瘤周围纤维结缔组织增生更显著o。本研究显示Cx蛋白阳性定位多位于肿瘤组织与纤维组织交界区域，在不少成纤维细胞也呈现阳性表达，六味地黄丸作用后这些成纤维细胞构成的微环境是否促进了肿瘤细胞缝隙连接蛋白的表达，值得进一步探讨。118【参考文献1 Mesnil M，Yamasaki HBystander effect in herpessimplex virusth

15、ymidine kinase gancielovir cancer genetherapy： Role of gap-junctional intercellularcommunicationJCancer Res，2000，60(15)：39892杜标炎，张爱娟，谭宇蕙，等自杀基因系统联合六昧地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用J广州中医药大学学报，2008，25(4)：3193 杜标炎，王慧峰，谭字慧，等。六味地黄丸对小鼠移植性肝癌自杀基因治疗的增效作用J广州中医药大学学报，2007，24(2)：1324 Bamberger A M，Riethdorf L，MildeLangoseh K，et

16、a1Strongly reduced expression of the cell cycle inhibitorp27 in endometrial neoplasiaJVirchows Arch，1999，434(5)：4235刑毅飞，肖亚军，鲁功成，连接蛋白介导的GJIC与肿瘤自杀基因治疗时旁观者效应的关系J国外医学生理、理科学与临床分册，2001，21(4)：2466Kumar N M，Gilula N BThe gap junctioncommunication channelJCell，1996，84(3)：3817 Mesnil M，Piecoli C，Tiraby G，et a

17、1Bystander killing ofcancer cells by herpes simplex virus thymidine kinasegene is mediated by connexinsJProc Natl Acad SciUSA，1996，93(5)：18318 毛丽敏，王勤，王菊芳，等肿瘤细胞的间隙连接J国外医学肿瘤学分册，2003，30(4)：2649Zhang L x，Acevedo P，Guo H，et a1Upregulation of gapjunctional communication and eonnexin43 geneexpression by carotenoids in human dermal fibroblastsbut not in human keratinocytesJMol Carcinog，1995，12(1)：5010 姜廷良，严述常，王素芬，等六味地黄丸防治肿瘤的实验研究J中药方剂研究，1983，21(6)：71责任编辑聂淑琴万方数据