椎间盘退变的分子生物学机制及基因治疗前景.pdf

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1、1940 虫堡匿堂苤查!塑!生!旦!旦筮!鲞筮呈!翅奠塾!丛型堡!i坠，!Y!：!Q盟：y!：盟!：!椎间盘退变的分子生物学机制及基因治疗前景肖斌田伟人类的脊柱由23个椎间盘将椎体连接在一起，从颈椎到腰椎，椎间盘约占脊柱长度的20一30，其有着使脊柱具有活动性及缓冲各向应力的作用。人类椎间盘退变从20岁开始，在尸体标本上，在49岁时，大约有97的椎间盘已经退变或有退变迹象旧o。目前对椎间盘退变所引起的疾病主要的治疗观点是：(1)保守治疗，应用非类固醇抗炎药(NsAIDs)等控制炎症反应；(2)手术治疗，脊柱融合或近年来新发展的脊柱关节成型术等。但以上方法仅能有限地缓解椎间盘退变所引起的症状，而

2、不能从根本上逆转椎间盘退变的过程。所以随着现代科学的发展，对椎间盘退变的研究逐渐转变到分子生物学水平，并且越来越多的研究者开始关注基因治疗在椎间盘退变中的应用。1椎间盘的结构：椎问盘是一个缺乏血管分布、富含纤维及软骨成分的组织，细胞数量少而细胞外基质丰富。从大体标本上看，主要由外部的纤维环(分为外层和内层纤维环)、内部的髓核及两部分之间的过渡区域组成，其上下通过软骨终板与椎体相连，有些人将其形容为“sandwich”结构。在胚胎发育过程中，脊柱主要由中央的脊索及周围的间充质细胞形成，脊索细胞形成髓核，其富含脊索细胞和蛋白多糖；间充质细胞形成周围环绕的纤维环，其富含成纤维样细胞及胶原纤维，髓核及

3、纤维环之间的过渡区域界限较分明。而后在已形成的椎间盘的上方和下方，脊索逐渐被间充质细胞所代替，形成软骨和骨性终板。婴儿出生后，脊索细胞逐渐减少，被间充质细胞所代替，出现软骨样细胞口o。人类的脊索细胞在10岁左右基本消失，而其他物种可在成年后的椎间盘中发现脊索细胞。在成年人的椎间盘中，细胞成分非常少，仅为组织容积的15H o，髓核的细胞密度约为4106cm3，纤维环约为9106cm3，明显少于成熟的透明软骨的密度，1410 7cm“。外层纤维环中主要存在纤维细胞和成纤维细胞，内层纤维环及髓核中，主要存在软骨样细胞J，并且过渡区逐渐消失，纤维环和髓核的界限不明显。细胞外基质主要由胶原(collag

4、en)和蛋白多糖(pmteoglycan)组成。胶原占外层纤维环干重的70，占髓核干重的20【5 J。目前人体内已知的胶原共19种，在椎间盘中有I、X型胶原等9种o，组成椎问盘纤维胶原架构的主要是I型和型胶原，它们约占基金项目：北京市自然科学基金资助项目(707加34)作者单位：100035北京积水潭医院脊柱外科通讯作者：田伟，Emil：tiweia163bjcom综述总胶原的80。在外层纤维环，主要由I型胶原构成，呈向内逐渐递减的趋势，髓核中没有I型胶原。而型胶原的分布却正相反，80聚集在髓核中，呈向外逐渐递减的趋势u引。蛋白多糖分布在各层胶原纤维之间，在髓核含量最高，占髓核干重的50心“。

5、蛋白多糖是由一个蛋白核心和附着于其上的氨基葡聚糖(91ycosaminoglycan，GAG)链构成，蛋白核心主要由透明质酸和连接蛋白构成，氨基葡聚糖主要由硫酸软骨素和硫酸角质素构成旧1。在椎问盘组织中，最主要的蛋白多糖是聚集蛋白聚糖(aggrecan)，因为其硫酸软骨素和硫酸角质素的含量较高，具有较高的渗透压，使之具有抵抗压力的特性。瑚J。蛋白多糖具有亲水性，所以能使髓核吸收并保持水分，这一特点不但可以使椎间盘具有吸收应力机械特性，并且在椎间盘的新陈代谢中起到了促进物质交换的作用1引。椎间盘几乎没有血管分布，位于其中心的细胞距最近的毛细血管至少8 mm哺J，所以主要通过软骨终板的渗透作用与外

6、界进行物质交换，其微环境具有弱酸性、低氧浓度、少营养物质等特点，椎问盘细胞主要通过葡萄糖无氧酵解获取ATP，并产生乳酸一。1。2椎间盘退变的分子生物学机制：在椎间盘退变的研究中，越来越多的人注意到退变是因为合成代谢和分解代谢的不平衡所引起的o 7“4“。合成代谢能力的下降及分解代谢能力的增强，使细胞外基质中蛋白多糖和型胶原的含量下降，髓核的含水量降低，继而椎间盘高度下降，在磁共振成像上表现出椎间盘退变的征象。并且其承受应力的能力下降，造成纤维环撕裂，椎间盘突出；关节突关节退变、增生；黄韧带肥厚等病理生理变化，引起临床上的椎问盘突出、椎管狭窄等退行性改变，产生神经症状。在椎间盘退变研究中，有一系

7、列细胞因子来调节控制其新陈代谢，其中一部分通过体内或体外实验的方法证实可以减缓或逆转椎问盘退变。在合成代谢中，转移生长因子(TGF)B、骨形态发生蛋白(BMPs)、胰岛素样生长因子(IGF)1、so妇等被证实具有促进蛋白多糖和型胶原合成的作用2，16驯；在分解代谢中，白细胞介素(IL)1、肿瘤坏死因子(TNF)一仅、基质金属蛋白酶(MMPs)、ADAMTs等可促进蛋白多糖和型胶原的降解H212 3|。并且跏k等协1通过免疫组化的方法证明突出的椎间盘中存在Fas及FasL，可引起细胞凋亡。BMPs属TGFB超家族中的成员，在c末端具有7个半光氨酸的高度同源性旧5|。其在20世纪60年代被发现，至

8、今已经发现40余种。BMPs以二聚体形式存在，与细胞膜上万方数据生堡医堂盘查!盟笙!旦!旦筮!鲞筮!翅盟堂丛旦坚!，!Y!：!Q盟：!，丛!：12的BMPs受体结合(BMPR)，使细胞质中的smad蛋白磷酸化，作为第二信史进入细胞核，引起趋化、增殖或分化等作用。头蛋白(noggin)可以与BMP_2，4，6，7结合，并且抑制其活性J。BMPs具有骨诱导性，许多骨科医生十分关注其在骨融合中的作用，并且美国FDA已经批准BMP一2和BMP-7(0P一1)应用于临床旧7J。利用体外实验的方法证实在椎问盘修复的过程中，rhBMP-2可以促进细胞增殖及蛋白多糖的合成，并且增加型胶原、聚集蛋白聚糖、sox

9、9的基因表达，并且可以保持软骨细胞表形。“等1进一步证实rhBMP_2可以上调BMP_7、7rGFB的基因表达，而对BMPR无明显影响。zhang等拉引证实在刺激蛋白多糖的合成中，BMP-2和BMP_7的作用最强，而在刺激胶原合成中，BMP4和BMP，14的作用最强。Kim等叫证实rhBMP-2应用于人类椎间盘细胞中不会引起成骨蛋白的表达，说明rhBMP2在椎问盘细胞中具有保持软骨细胞表形的作用，而非成骨作用。MMPs目前发现20种以上，它们都具有疏水的N末端，一段高度保留的PRcGVPD序列，一个zn2+结合区域，并且都需要被ca2+激活等特性H J。MMPs分为4个亚类：胶原酶(MMP1，

10、8，13)，可以分解I、型胶原的三螺旋结构；残存的结构可以被明胶酶(MMP之，9)进一步分解；基质溶解酶stromelysin(MMP-3)与之作用相似，并且可以分解蛋白多糖及纤维连接素等结构。基质溶解酶m枷ly船es(MMP-7或PuMP)被认为在关节软骨的退变中起重要的作用H“。据Bonassar等u报道，激活MMPs可使组织中80GAG8降解，并使胶原架构严重变性。最近的研究中发现聚集蛋白聚糖酶(aggrecaIl鹊es)也为分解代谢中的重要因素，其归为ADAMTS (a disinte酾n and metalloprotease五thtllmmbospondin1ike repeat)

11、家族21。22，aggrecanases一1、2分另4为ADAMTS_4、5，主要分解聚集蛋白聚糖，从而引起蛋白多糖的减少。在突出椎问盘周围有毛细血管长入，而在血管附近MMPs的染色呈阳性，提示血管细胞也可以产生MMPs旧1|，而且加之炎症因子的浸润，更加促进椎间盘的退变。在合成和分解代谢过程中，细胞因子之间可以相互发生协同，如BMPs的异二聚体的活性为同源二聚体的20倍H，IL1可以增加MMPs的作用等H J。另外，还存在一类调节因子，如LMP(UM mineralization pmtein)一l、1rIMP(tissusinhibitor of MMP)、So】(9等。LMP一1是一种细

12、胞间的调节因子，可以诱导白细胞和成骨细胞分泌不同种类的BMPs，并且可以保持椎间盘细胞的软骨表形u“。Yoon等副证实LMP1可以通过上调BMPs(尤其是BMP_2和BMP_7)增加蛋白多糖的合成。TIMP为MMPs和ADAM，IS的内源性抑制因子，目前发现3个亚型，wallach等一23将人类退变椎间盘细胞培养并用AdTIMP1转染，证实可以提高蛋白多糖的含量。随着合成分解代谢平衡被打破，椎间盘的微环境也发生改变。软骨终板退变、钙化，使渗透率和有效渗透面积下降”J，椎间盘内外物质交换效率降低，椎间盘内氧浓度和葡萄糖浓度下降，乳酸堆积，pH值下降。在研究中发现，长期摄入尼古丁可引起终板处毛细血

13、管床的重建，影响渗透效率，3埘J，这也从分子水平阐明了吸烟为椎间盘退变的一个危险因素。在氧浓度为5时，细胞外基质的合成率最高，而氧浓度降至1时，细胞外基质的合成率仅有峰值的20。同样pH 70时细胞外基质的合成率为pH 74时的140，在pH 6O时，即使有足够的葡萄糖，细胞的活性也会明显减弱。如果葡萄糖的浓度持续低于02 mmoLL，细胞将在24 h内开始死亡。3椎问盘退变的基因治疗：基因治疗的概念最早于1972年提出脚j，现在指将遗传物质(DNA或RNA)转至靶细胞中，通过取代缺陷序列来治疗先天性疾病，或增加某些对人类有利的蛋白产量。后者即为椎间盘退变基因治疗的目的，通过增加合成代谢的细胞

14、因子，减少分解代谢的细胞因子，从而增加细胞外基质的含量，保持椎间盘的含水量、高度及生理功能。在人们认识细胞因子的早期，有些研究者将细胞因子直接应用到靶器官，如应用rhBMP_2于人椎间植骨区域，已经证实了可促进骨融合率旧刮；应用rhBMP_7在兔子椎间盘注射也可以增加正常椎间隙的高度并减缓退变椎间隙的高度丢失7|。但椎间盘退变是一个持续的缓慢的过程，而这些水溶性细胞因子的半衰期又相对较短，而且较易扩散，所以反复的椎间盘内注射并非是较好的临床选择旧”。目前应用于临床的细胞因子价格昂贵，应用TGF治疗类风湿性关节炎，每年的花费要超过10 000美元，应用BMPs促进骨愈合，每次治疗的花费大约500

15、0美元7|，使普通患者难以接受。基因治疗的方法即可使蛋白在椎间盘中得到高水平的持续表达。现在利用分子生物学技术，设计特定引物，将细胞因子mRNA提取出来，并利用RTPcR合成cDNA，继而将cDNA通过载体转染到靶细胞中，使细胞因子基因在靶细胞中持续表达，产生相应的细胞因子，从而增加细胞外基质的合成，减缓或逆转椎间盘退变。在基因治疗中，首先要选择目的基因，即促进细胞外基质合成的细胞因子：TGFB、BMPs、IGFl、LMP-1、so圆等，和抑制细胞外基质分解的细胞因子：MPs、IL一1Ra等。以上均可作为椎问盘退变治疗的候选基因。有些学者应用开展多基因研究，利用细胞因子之间的协同作用，增加基因

16、治疗效果，有些文献将其形容为“gene cocktail，“。载体被分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒具有容易进入哺乳动物细胞并进行DNA的复制、转录和表达的特性，所以将目的基因插入病毒基因的序列中，制造出一个“trojan horse”，将外源性基因带入到宿主细胞内并进行表达u。常用的病毒载体有腺病毒、副腺病毒(AVV)、逆转录病毒和疱疹病毒等。病毒载的优点为转染率高、突变率低，但同时可引起病毒自身基因的表达，有全身病毒感染的危险，并且病毒蛋白的免疫源性可激发免疫反应，影响基因治疗效果。非病毒载体的方法包括裸DNA注射、基因枪(genegtln)、质粒等，其转染效率要低于病毒载体，但不会带

17、来病毒万方数据坚堡医堂苤盍呈塑!至!旦!旦筮!鲞筮!塑盟型丛鲤g堕i坚：!z 12：!垒盟：y亟!：丛：!Z基因表达的副作用，免疫源性也相对较低心11J。Y00n等副已利用腺病毒为载体将LMP-1(AdLMP-1)转染到sD大鼠椎问盘细胞中，分别在体内和体外证实其可以增加蛋白多糖的合成。基因治疗主要分为两种方式：(直接)体内基因转移和(间接)体外基因转移。前者指将带有目的基因的载体直接注入到椎间盘中，在体内进行转染过程，而后进行基因表达；而后者指取少量髓核组织，分离其中的软骨样细胞或从骨髓、脂肪等组织中分离出间充质干细胞进行体外培养，用带有目的基因的载体在体外进行转染，再将已具备目的基因的细胞

18、注入到退变的椎间盘中n11538。由于严重退变的椎间盘中具有活性的靶细胞数量较少，所以往往采用体外基因转移的方式进行基因治疗。4基因治疗的前景：椎间盘退变是一个多因素参与的复杂过程，目前所开展的基础性研究还十分有限，这与椎间盘组织取材困难，理想的动物模型较少有关，并且椎间盘组织本身细胞数量少，均埋藏在富含胶原和蛋白多糖的细胞外基质中，分离、培养等难度较大。基因治疗是现代医学发展的一个分支，目前仅应用在少数治疗基因缺陷性疾病的治疗中，而对退行性疾病的治疗研究较少，所以在此领域的研究也具有较广阔的前景。椎间盘组织一直被认为是免疫豁免器官，这是基因治疗的一大优势，其归因于缺少血管及淋巴管分布、缺乏自

19、身的炎性细胞。近些年的研究发现，如同视网膜及睾丸组织，椎间盘细胞局部表达F鹪L，可以引起Fas阳性的T细胞凋亡，从而逃避免疫系统的攻击5|。退变椎间盘的周围有毛细血管的长入，再加上各种载体，尤其是病毒载体具有免疫源性，这就有可能引起免疫反应。在一部分已进行的免疫系统完整的动物实验中，用腺病毒为载体转染实验对象产生了不同程度的免疫反应，影响基因的表达口。有些研究利用免疫抑制剂，如环磷酰胺，可以提高基因的表达效率瞄J。在已经退变的椎间盘中，细胞外基质的基础合成率非常低。但已通过动物实验证实，退变和非退变的椎间盘暴露于同样的BMP-7中，有着相同或相似的细胞外基质的产量1，这一点说明基因治疗在椎间盘

20、退变治疗中潜在的临床价值。但同时应注意，退变的椎问盘终板钙化，有效渗透面积及渗透能力降低，其营养供应十分有限，而基因治疗可能增加细胞数量或增强细胞活性，营养支持难以满足其需求，在这种情况下，可能会造成治疗失败u“”1。基因治疗的原则是不仅有效，而且安全。目前对椎间盘退变基因治疗安全性评价的相关研究非常有限，任何基因的过度表达都可能会带来灾难性的后果，如椎间盘骨化、椎问融合、椎间盘突出、神经损伤，甚至染色体突变、肿瘤形成等。将超治疗量的AdBMP-2注射到新西兰白兔的硬膜下腔后引起截瘫H引，病理证实为严重的炎性反应和大量多纤维母样细胞浸润。所以在基因治疗正式应用于人体前，应开展长期而全面的安全性

21、评价。 另外由诺贝尔医学奖获得者A如Fire和CraigMeuow所提出的RNA干扰(RNAi、RNA inte血rence)技术H“，也有希望应用于退变椎间盘的基因治疗。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，通过引入siRNA(8mallinte血ring RNA)，激活 sc(RNAinduced silencingcomplex)，降解目的mRNA，从而实现基因沉默，抑制目的基因的表达m。此项技术已在神经科、眼科及肿瘤治疗等领域开展临床研究旧1，今后也可通过RNAi技术，减少细胞外基质的分解因子(如MMPs等)在退变椎间盘中的表达，开展基因治疗。椎间盘退变的基因治疗理念已经逐渐被脊

22、柱外科医生所关注，在国外大多还处于动物实验阶段，国内几乎为空白。该技术通过选择适当的细胞因子，通过安全而又高效的载体将目的基因整合到宿主靶细胞中，使蛋白得到持续表达，增加椎间盘细胞外基质的含量，从而可以减缓或逆转椎间盘的退变。在不久的将来，如果基因治疗应用于临床并取得较好的效果，这将是脊柱外科发展史上的一次重大革命，并且可以运用到其他退行性疾病的治疗领域，如骨性关节炎等，以最小的创伤获得最大及最有效的治疗效果，恢复机体退变组织的生理结构和功能。参考文献1R0ughley PJ Bi010盱of intertebral disc agi“g allddegenerationSpine，2004，

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41、医学上的应用一书。注意单位名称与单位符号不可混合使用，如ngkg天。应改为ngkgd；组合单位符号中表示相除的斜线多于1条时，应采用负数幂的形式表示，如ngkgIIIin应采用ngkglIlin1的形式；组合单位中斜线和负数幂亦不可混用，如前例不宜采用ngkglnin。1读者作者编者的形式。在首次出现不常用的法定计量单位处用括号加注与旧制单位的换算系数，下文再出现时只列法定计量单位。人体及动物体内的压力单位使用mm Hg或cm H：O，但文中首次出现时用括号加注(1咖Hg=0133 kPa)。正文中时间的表达，凡前面带有具体数据者应采用d、h、min、s，而不用天、小时、分钟、秒。量的符号一律用斜体字母，如吸光度(旧称光密度)的符号为A，“为斜体字。万方数据