骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损.pdf

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1、中国组织工程研究与临床康复舅II卷第41,期2007-1014卅版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchOctoberl4，,2007 V0111，No41综述骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损翟波，刘丹平Bone morphogenetic protein in gene therapy of bone defectAbstractoBJECTIVE：To summarize the development of bone morphogenetic protein on gene t卜=erapy of bone defe

2、ct i113 bonetissue engineeringDATA SoURCES：Pubmed database was undertaken to identi哪the relevant articles on bone morphogenetic protein ingene therapy of bone defect published from Januarry 1 990 to January 2007 with the key words of“bone morphogeneticprotein，tissue engineeringgene therapy，bone defe

3、ct*in EnglishSTUDY SELECTION：Arthles on bone mOrphogenetic protein i113 gene therapy of bone defect were selectedand thentopics of alll articles and abstracts of most articles were checked 1nclusive criterion included articles about bonemorphogenetic protein and gene therapy of bone defectExclusive

4、cdteria included articles wtith repe,titive research andMeta analysisDATA EXTRACTIoN：Totally 99 articles on bone morphogenetic protein and gene therapy of bone defed wereretrieved and 30 articles met the inclusive criterion were includedDATA SYNTHESIS：Bone tissue engineering is a significant part of

5、 tissue engineeringIt referrs to repair or reconstructbone tissue defect based on tissue engineering，jincluding seed ceilssbecified cytokine and carderBone morphogeneticprotein iis a kind of hydrophobic acidic proteinIt has been verifiedin clinic that bone morphogenetic protein can faciiitatebone he

6、aling and are considered as the most powerful osteoinduI：live fa,ctora at present G q,ene therapy。in many waysrepresents an ideal approach for augmenting boRe regeneration and allows specific gene products to be delivered to aprecise anatomic IocationBone morphogenetic protein gene in bone tissue en

7、gineering folbone defect has become anew hot study currentlyThe expression and fu alnction of bone morphlogJenetic protein and bore morphoglenetic protein inbone tissues have been studied for a long time because of their remarkable biological anctionCONCLUSIoN： Bone morphloglenetic protein in gene t

8、heraPY can successively iinduce the occurrence of bone andcartilagewhich develops a new approach for bone defectZhai BUu DP Bone morphogenetic protein in gene therapy of bone defectZhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Unchuang Kangfu2007；11(41)：8333-8336(China) wwwzglckfcomlzglckflejoumallupfilesl07-4

9、1141k-8333(ps),PUt摘要目的：总结骨形态发生蛋白在骨组织工程基因治疗骨缺损中的进展。资料来源：应用计算机检索PubMed数据库1990一012(007-01相关骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损方面的文献。检索词“BMP，tissue engineerilnggene therapy，bone defect”，限定文献语言种类为English。资料选择：选取包括骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损的文献，阅读全部文章的文题和大部分文章的摘要。纳入标准：文章所述涉及骨形态发生蛋白及其基因治疗骨缺损。排除标准：重复性研究和Meta分析类文章。资料提炼：共检索到99篇关于骨形态发生蛋白及基因治疗骨

10、缺损的文献，最终纳入30篇符合标准的文献。资料综合：骨组织工程是组织工程学的重要组成部分，它是指利用组织工程学进行骨组织缺损的修复或重建，包括种子细胞、特定的细胞因子和载体。骨形态发生蛋白是一种疏水性酸性蛋白质，在临床实践中，已证实其能促进骨愈合，被认为是目前最强有力的一种骨诱导因子。基因治疗在许多方面都代表了一种增进骨再生方法的理念。其允许特异的基因产物转移至精确的解剖学部位。运用骨形态发生蛋白基因于骨组织工程领域以治疗骨缺损是目前新的热点。骨组织中的骨形态发生蛋白以及骨形态发生蛋白的表达和功能由于他们显著的生物学作用而被长时间的研究。结论：应用骨形态发生蛋白基因疗法可以成功诱导骨和软骨的发

11、生，为骨缺损的治疗开辟了新的解决途径。关键词：骨形态发生蛋白；骨缺损；基因治疗；组织工程；综述文献翟波，刘丹平骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损【J】中国组织工程研究与临床康复，200711(41)：8333-8336wwwzglckf comlzglckflejoumaYupffiles07-4141k-8333(ps)pdq0引言20世纪80年代组织工程的提出，使得对于骨缺损修复领域的研究有了长足进步，并广泛应用于临床实践。骨骼再生或骨愈合可以说是胚胎骨发育过程的重演，它受多种生长因子调控，但是骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)是其中最重要的一种。大量实

12、验结果表明，它是目前最为有沈阳1200邮政信箱110004 kf23385083一!sinacorn wwwzglckfcorn效和富有前景的骨诱导因子。BMP是Urisl【首次发现的，Urist将脱钙骨基质(decalcifiedbone mafrix，DBM)植入同种动物的肌肉内，结果可诱导异位新骨形成，脱钙骨基质经进一步分离提纯被证明是蛋白质分子，因此命名为BMP。目前对于应用BMP的效果已经进行了广泛的临床前研究，并且为临床引进了最有效的BMP(BMP一2、7)。近来的研究显示了BMP在脑、心、肾、皮肤和胃肠新的作用【1ta。作者应用计算机检索PubMed数据库1990一Zhai 13

13、0Studyingfor m=sters degreeFirst 矾【liatedHospitalLiaoningMedicaI University,Jinzhou 121000Liaonilng ProvinceC；hinazhaib01981yahoomcnReceIved：2007-04-07AcceDIed：2007-04-26辽宁医学院附属第一医院辽宁省锦州市1210100霍波男1981年生辽宁省沈阳市人汉族辽宁医学院在读硕士主要从事骨组织工程治疗骨不连、骨缺掘的研究。zhaib01981yahoom cn中圈分类号：R34983文献标识码：A文章编号：167225(2007)41

14、-08333-04牧穰日期：2007-0枷7謦回日期：2007*26(0750_4_2129WLQ)8333蓦勰融静万方数据翟波等骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损 wwzglckfcom kf23385083sinacomISSN1673 8225 CN 21 539R101200701相关BMP基因治疗骨缺损方面的文献，经归纳总结，拟对BMP的研究进展及其在基因治疗骨缺损过程中的作用作一综述。1 骨形态发生蛋白的概论11 骨形态发生蛋白的结构及其生化特性 BMP是一种疏水性酸性蛋白质，M，18 000左右，由10余种氨基酸组成，在酸性条件下性能稳定，pH 72的溶液中有一定的溶解度，pH85完全

15、失活。通过对BMP氨基酸序列分析得知，大部分BMP在其羧基端部分都包括特征性的7个高度保守的半胱氨酸残基，因而BMP除了BMP一1以外均属于转化生长因子B(Transfer GrowthFactor-p，TGF-B)超家族成员，并且是转化生长因子13超家族中最大且增加最快的一个蛋白家族【3,4】。到目前为止，BMP家族已经有30多个成员，其中15种BMP是哺乳动物来源的，近20种BMP的基因被成功克隆BMP广泛地存在于猪、牛、羊、兔、鼠及人的骨、胚胎、血细胞、肾和脾脏等组织中，且在不同种属间有较高的同源性。目前，BMP家族按其同源性分析可分成4个亚群：BMP-2、4(氨基酸序列92相同)为同一

16、亚群；BMP-5、6、7为同一亚群；BMP-3、12、13、14为同一亚群；BMP-3b为一个亚群。另外，BMP免疫原性低，一般不引起免疫排斥反应，只有轻微的刺激能力。研究表明，BMP3的成骨诱导活性依赖实验条件和分化阶段，已经在体内显示了其骨诱导性，但是它同样也可以因为其他BMP的存在而被抑制。如BMP一2和BMP一7，而且在动物模型中，它是生后骨密度的负调节蛋白5-7。在临床实践中，已证实BMP能促进骨愈合，被认为是目前最强有力的一种骨诱导因子。12 骨形态发生蛋白的信号转导121 骨形态发生蛋白的受体 BMP作用的发挥是通过其受体介导来完成的，其受体主要有两型：BMP I型和BMPll型

17、受体。两型受体都属于丝氨酸，苏氨酸激酶受体类，在信号转导中，两型受体都是必需的。BMP作用时首先和型受体结合并使其活化，然后I型受体和其结合在活化的型受体作用下通过转磷酸基被激活使信号得以传递。BMP I和BMP与配体结合力都不强，只有在I、型受体形成复合物后，才与配体有高亲和力。尽管不同的BMP和其受体的亲和性不同，但其发挥作用的关键步骤都是最终和I型受体结合。122骨形态发生蛋白的信号传导BMP结合BMPI型和型受体，这两个受体都是信号传导所必须的8-10。BMP作用时首先和靶细胞表面的型受体结合并使其活化，然后再和I型受体蛋白相结合，在活化8334的I型受体作用下通过转磷酸基激活SMAD

18、s途径使信号得以传递。SMADs蛋白根据其结构和功能特点，分为3组。第1组为受体调节型SMAD(receptor-regulated smad，R-SMAD)包括SMADl、5、8和SMAD2、3； 第2组为共同结合型SMAD(common smad，CoSMAD)，在哺乳类动物为SMAD4，而爪蟾蜍还包括SMADl0；第3组为抑制型SMAD(inhabitory smad，ISMAD)，包括SMAD6、7。其中第1组分子C末端具有特征性丝氨酸(ssxs)，可被I型活化受体磷酸化，而第2、3组无此序列。SMAD4是通用型，以蛋白三聚体形式存在，是不同转化生长因子13超家族成员信号转导所必需的中

19、心介导分子。第3组SMAD6，SMAD7可抑制第一组SMADs分子的磷酸化或者干扰与Co-SMAD的结合从而抑制转化生长因子13家族成员信号传递，同时，I-SMAD的转录却是由转化生长因子B成员引导的，这样就形成了一个SMAD的负反馈调节机制。当BMP I型受体激活胞浆内以同源二聚体或三聚体存在的第一组SMADs分子，其中SMADl、SMAD5和SMAD8是BMP的效应分子，SMAD2和SMAD3是Activins和转化生长因子13的效应分子。然后，经磷酸化激活的第1组R-SMADs分子与SMAD4三聚体结合形成异源六聚体或其他形式寡聚体，并转移至核内，单独或与SchnurripDR|-BFl

20、等基因产物同源物结合后激活特定靶基因，这时SMADs复合体就可以根据具体的内环境循环启动两套系统：协同激活因子系统或者协同抑制因子系统，从而在适宜的程度上控制这一生物学行为H1-13。在BMP-SMAD的作用机制过程中，还存在着noggin、chordin、cerberus和foIlistatin等细胞外BMP拮抗剂，使BMP失去与其特异性受体的结合，从而不能活化BMP信号途径1141。在首次发现BMP拮抗剂之后，大量BMP拮抗剂被先后发现，这些拮抗剂是具有半胱氨酸序列的分泌性蛋白剧12151。爪蟾胚胎能表达一种丝，苏氨酸激酶受体的伪受体BAM BI，它的结构类似于I型丝，苏氨酸激酶受体，却没

21、有I型受体的细胞内结构域。在BMP配体作用下。BAMBI可稳定地作用于BMP I型或型受体，从而使之失去与BMP的结合能力，这种拮抗作用是由BMP诱导的并自动调节信号传递，属于一种负反馈调节机制。此外，在细胞胞浆及核内基因水平还存在着更为复杂的调节机制，正是这两种正负反馈调节机制保证了BMP的作用在顺序、时间和空间上的精确性。13骨形态发生蛋白诱导成骨的机制 诱导成骨的形成是一个较复杂的连续性变化过程，随着不同时期、组织学和组织化学呈现连续且又具有显著阶段性的变化。田POBox 1200Shenyang 1 10004 kf23385083sinaoorn w州zglckf corn万方数据I

22、SSN 16738225 CN 211539Rwwwzglckfcom kf23385083sinaoom 翟波，等骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损卫东等通过对牛BMP植入小鼠肌肉内诱导成骨的研究，结合组织学和组织化学观察特点，将其全过程分为4个时期：即间充质细胞增生期(35 d)；软骨细胞分化期(7 d)；新骨形成期(14 d)；骨细胞成熟期(21 d)。这样从形态和功能角度反映了BMP诱导成骨的全部演变过程。在间充质细胞增生期内部分细胞存在核分裂象。现已明确，BMP是诱导成骨的启动因子。诱导成骨必须具备3个条件：诱导因子的存在。当局部BMP浓度达到一定程度，就可以诱导骨生成。BMP靶细胞群的存

23、在。BMP靶细胞包括诱导性成骨细胞、结缔组织中未分化的、有活力的间充质细胞、骨膜基质细胞和骨膜细胞等。允许骨生长的正常血液供应环境。一般认为BMP的作用无种属特异性，具有跨动物种属诱导成骨的能力。其诱导过程分两步：首先增补向骨祖细胞分化的问充质细胞，刺激骨祖细胞成熟为骨系细胞；再由骨衍生因子(Bone Derived GrowthFactor，BDGF)刺激这些细胞发生有丝分裂，故而形成大量新骨。2基因治疗基因治疗是将人正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的一种生物医学高技术。1990年，美国NIH的Freuch Anderso

24、n博士开始了世界上第一个真正意义上的基因治疗临床试验，他们用ADA(腺苷酸脱氨酶)基因治疗了一位因ADA基因缺陷导致严重免疫缺损(severe combinedimmunodeficiency，SCID)的4岁女孩，并获得了初步成功，促使世界各国都掀起了基因治疗的研究热洲181。2000年，法国巴黎内克尔(Necker)L童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能。取得了基因治疗开展近10年来最大的成功171。200401，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第1个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液(商品名：今又生)正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑I侧。基因治

25、疗的实施需具备两个条件，成熟的DNA重组技术和合适的基因转移技术，其中，基因转移技术是基因治疗的关键和基础。目前，实施基因转移的方法主要包括in vitro、in vivo和ex vivo 3种方法I协211。其中in vivo法的优点是操作简单、医师和患者容易接受、易于推广；缺点是目的基因在体内易被代谢分解、转染效率相对较低、很难控制目的基因转染到特定的靶细胞，而且有些组织(如骨和软骨等)难以穿透、目的基因到达困难。ex vivo法优点在于易于选择和控制被转染的沈阳1200邮政信箱110004 Id23385083sinaoofn wwwzglc耘fm靶细胞，减轻免疫排斥反应，且可以复合各种

26、承载体，回植前还可以进行安全检查，此外，人体其他组织细胞不受基因转染的影响，技术路线成熟，效果容易控制，缺点是操作复杂，技术含量要求高，很难在临床推广使用。总的来说，in vivo和ex viVO这两种方法各有优势，同时又各有局限性。目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性的多聚物、以及脂质体，多聚物DNA复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向阎。病毒载体

27、在基因治疗领域的应用最为广泛，约70的治疗方案采用了病毒载体。腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点；但第一代腺病毒仍然存在许多缺点，如外源基因表达时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等。近年来对腺病毒栽体的改造非常活跃，产生了许多更安全、更有效的载体，如无病毒基因的无肠型腺病毒载体、靶向性病毒载体、复制型腺病毒等23241。3骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损的实验研究骨缺损的治疗一直是骨科领域的难题。目前，临床治疗骨缺损的方法主要有自体、异体骨移植和假体植入3种。自体骨移植所能提供的骨有限，还会引起供区疼痛及感染

28、等一系列严重的并发症。异体骨移植和假体植入只能产生很弱的骨诱导能力，主要是起到骨传导的作用，应用异体骨还存在感染、免疫排斥及传染各种疾病的潜在可能，假体植入由于植入物降解速度较慢，这样就妨碍了新骨的生成和重塑。因此，自体、异体骨移植和假体植入的应用受到了一定的限制。BMP基因治疗骨缺损的提出和发展为解决这一科学难题开辟了新的解决途径。Baltzer等【2司把BMP-2 cDNA通过腺病毒载体直接导入兔骨缺损处，术后8周行放射学及病理学检查，见缺损处新骨形成量明显高于对照组，术后12周的生物力学检测结果满意。直接法取得一定的诱导骨形成的效果，同时提示必须降低受体对载体的免疫反应。鉴于直接法存在的

29、问题使更多学者开始应用间接法，并热衷于有成骨潜能的骨髓间质干细胞的研究。Lieberman等126】采用了间接体内基因治疗(ex vivo)的方法，将整合有BMP-2基因的腺病毒载体(AV)转染8335万方数据ISSN 16738225 CN 211539R翟 波，等骨形态发生蛋白基因治疗骨缺损”似删倒玎丘圮置姐卯阳蓬黏臆。册骨髓基质细胞系W-20，采用Westem bIot法检测到转染后3 d和1周BMP一2的有效表达，并将转染后的W20细胞植入到裸鼠体内肌肉中和股骨缺损处，结果有大量的新骨形成。Lee等【27l以腺病毒表达BMP-2转导肌源性细胞，行体外基因治疗，修复SClD鼠的颅骨缺损获

30、成功，并用Y2特异染色体荧光原位杂交技术发现，绝大多数移植受体细胞位于新生骨质表面，通过骨钙素免疫组织化学证实小部分转导的肌源性细胞转化为成骨细胞，说明肌源性细胞可作为成骨前体细胞。MusgraVe等【281也证实人肌源性细胞可以经腺病毒转导BMP2，通过体外基因治疗在鼠下肢肌肉内异位骨化。Lu等【冽用肌源性间充质干细胞复合BMP，以组织工程方法修复动物模型骨缺损获得成功，为构建骨组织工程提供了一种新模式。在最近的一项研究中，Dragoo等【删利用BMP-2基因转染的脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞，复合材料后植入裸鼠体内异位成骨，结果经转染组获得成骨，而对照组并未发14现骨形成。4总结

31、长期以来，大量骨科患者骨缺损的修复就是骨科临床所需解决的重要问题。虽然患者的自体骨移植方 17法效果很好，但却存在来源有限、造成患者手术创伤以 。及术后易感染等问题。运用BMP基因于骨组织工程领域以治疗骨缺损是目前新的热点。现有的研究资料已经证明，应用BMP基因疗法可以成功诱导骨和软骨的 20发生。但是限制BMP基因疗法应用于临床的最重要因素是针对异体细胞及病毒类载体的免疫排斥反应。正 21是这种排斥反应，限制了BMP基因诱导的成骨反应，而短暂的免疫抑制或许是解决这个矛盾的较好办法， 一不过在实际临床工作中，由于免疫抑制剂有较多的副 z作用。并不受到临床医生和患者的欢迎。在诸多有待解决的问题中

32、，分子生物学技术，对骨形成、骨修复和骨重塑以及软骨形成生理机制的基础研究工作，各种载 25体、承载体的设计、基因表达的调控和各种靶细胞的选择都是需要完善的。这样基因治疗骨科疾病才能产生 26令医患双方都满意的治疗结果，相信在不远的将来，基因治疗将会成为骨科疾病治疗方法中最为有效和经济 27的治疗手段之一：5参考文献1 EIolchkarev VAShardv AAdeveIopment and ha-r focb512526BMP signalingn仇entrd 0f skngrd响 D阡re帕ntiation 2004；72(910)：2 Leedham SJBmtan MMcDOnaH

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