食品中金黄色葡萄球菌检测方法 .docx

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1、精品名师归纳总结1. 范畴食品中金黄色葡萄球菌的检测方法可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。本标准第一法适用于金黄色葡萄球菌的定性检测。其次法适用于金黄色葡萄 球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。 第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。2. 设备和材料除微生物试验室常规灭菌及培育设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培育箱： 361。2.2 冰箱： 2 5。2.3 恒温水浴箱： 37 65。2.4 天平：感量。2.5 均质器。2.6 振荡器。2.7 无菌吸管： 1mL 具刻度、 10mL 具

2、刻度或微量移液器。2.8 无菌锥形瓶：容量 100mL、500mL。2.9 无菌培育皿：直径 90mm。2.10 注射器：。2.11 pH计或pH比色管或精密 pH试纸。2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 BD Crystal或Phoenix。2.13 比浊仪。BD Phoenix比浊仪，货号 440910。2.14 比浊仪定标盒。BD Phoenix定标盒，货号 440911。3. 培育基和试剂3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤。3.2 7.5 %氯化钠肉汤。3.3 血琼脂平板。 BD 货号脑心浸液琼脂 241830胰蛋白大豆琼脂 236950作为基础加兔血浆3.4 Baird-Park

3、er 琼脂平板。 BD 货号 2768403.5 脑心浸出液肉汤 BHI 。BD 货号 237400可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结3.6 稀释液：磷酸盐缓冲液。 BD 货号2115443.7 养分琼脂小斜面。 BD 货号2120003.8 革兰氏染色液。 BD 货号2125393.9 无菌生理盐水。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结4. 检验程序第一法 金黄色葡萄球菌的定性检验可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结金黄色葡萄球菌定性检验程序见图 1：检样25gmL 样品 225mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤，均质36118h 2

4、4hBaird-Parker 平板，血平板361血平板 18h24hBaird-Parker平板 18h 24h或 45h 48h涂片染色观看溶血BHI 肉汤和养分琼脂小斜面36118h 24h血浆凝固酶试验报告图 1 金黄色葡萄球菌检验程序5. 操作步骤5.1 样品的处理称取25g样品至盛有 225mL7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内， 8000r/min10000r/min均质1min 2min，或放入盛有 225mL7.5% 氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打1min2min。假设样品为液态，吸取 25mL样品至盛有

5、 225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶 瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠 中， 振荡混匀。5.2 增菌与别离培育可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结5.2.1 将上述样品匀液于 361培育 18h 24h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严峻时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。5.2.2 将上述培育物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培育 18h24h。Baird-Parker平板36 1培育 18h24h或45h48h。5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，菌落直

6、径为 2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，四周为一混浊带，在其外层有一透亮圈。用接种 针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落。 但无混浊带及透亮圈。长期储存的冷冻或干燥食品中所别离的菌落比典型菌落所产生 的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑 凸起、潮湿、金黄色有时为白色，菌落四周可见完全透亮溶血圈。挑取上述 菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。5.3 鉴定5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜，直径约为 1m。5.3.2 挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1个

7、或以上，分别接种到5mLBHI 和养分琼脂小斜面， 361培育 18h24h。然后挑取可疑菌落适用 Crystal肠杆菌 /非发酵菌鉴定试剂盒进行生化鉴定。6. 结果与报告6.1 结果判定：符合、，可判定为金黄色葡萄球菌。6.2 结果报告：在 25gmL 样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。其次法 金黄色葡萄球菌的 Baird-Parker 平板计数7. 检验程序金黄色葡萄球菌平板计数程序见图 2可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结检样25gmL 样品+225mL 稀释液，均质10 倍系列稀释挑选 2 3 个连续的相宜稀释度的样品匀液， 接种 Baird-Parker 平板36 14

8、5h48h计数及 Crystal 生化检验报告图 2 Baird-Parker 平板法检验程序8. 操作步骤8.1 样品的稀释8.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内， 8000r/min10000r/min 均质 1min2min，或置盛有 225mL 稀释液的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打 1min2min，制成 1:10 的样品匀液。8.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取 25mL 样品置盛有 225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 中，充分混匀， 制成 1:10 的样品匀液。8.1.3

9、 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9mL 稀释液的无菌试管中留意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面，振摇试管或换用 1 支 1mL 无菌吸管反复吹打使其混合匀称， 制成 1:100 的样品匀液。8.1.4 按操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次 1mL 无菌吸管或吸头。8.2 样品的接种依据对样品污染状况的估量， 挑选2个 3个相宜稀释度的样品匀液 液体样品可包括原液，在进行 10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1mL 样品匀液以、接种量分别加入三块 Baird-Parker平板，然后用无菌 L棒涂布整个平板，留

10、意不要触及平板边缘。使用前，如 Baird-Parker平板外表有水珠，可放在 25 50的培育箱里干燥，直到平板外表的水珠消逝。8.3 培育8.3.1 在通常情形下，涂布后，将平板静置 10min，如样液不易吸取，可将平板放在培育箱 36 1培育 1h。等样品匀液吸取后翻转平皿，倒置于培育箱， 361培育， 45h 48h。8.4 典型菌落计数和确认8.4.1 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，菌落直径为 2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，四周为一混浊带，在其外层有一透亮圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度， 偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落。 但无混可编辑资料

11、 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结浊带及透亮圈。长期储存的冷冻或干燥食品中所别离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。8.4.2 挑选有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板全部菌落数合计在 20CFU200CFU之间的平板，计数典型菌落数。a) 只有一个稀释度平板的菌落数在20CFU200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。b) 最低稀释度平板的菌落数小于 20CFU且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落。c) 某一稀释度平板的菌落数大于 200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落。d)

12、某一稀释度平板的菌落数大于 200CFU且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20CFU200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落。以上按公式 1运算e) 2个连续稀释度的平板菌落数均在 20CFU 200CFU之间，按公式 2运算。8.4.3 从典型菌落中任选 5个菌落小于 5个全选，分别按做血浆凝固酶试验。9. 结果运算公式 1：式中： T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数。 A 某一稀释度典型菌落的总数。B 某一稀释度血浆凝固酶阳性菌落数。C 某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数。 d 稀释因子。公式 2：可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结式中：

13、A 1B1 C1+ A 2B2 C2T =d可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数。A1 第一稀释度低稀释倍数典型菌落的总数。A2 其次稀释度高稀释倍数典型菌落的总数。B1 第一稀释度低稀释倍数血浆凝固酶阳性的菌落数。 B2 其次稀释度高稀释倍数血浆凝固酶阳性的菌落数。 C1 第一稀释度低稀释倍数用于血浆凝固酶试验的菌落数。 C2 其次稀释度高稀释倍数用于血浆凝固酶试验的菌落数1.1 运算系数。d 稀释因子第一稀释度。10. 结果与报告依据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数， 按9中公式运算， 报告每 gmL 样品中金黄色葡萄球菌数

14、，以 CFU/gmL 表示。如 T值为0， 就以小于 1乘以最低稀释倍数报告。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结第三法金黄色葡萄球菌 MPN 计数11. 检验程序金黄色葡萄球菌 MPN计数方法见图 3检样25gmL 样品+225mL 稀释液，均质10 倍系列稀挑选 3 个相宜稀释度的样品匀液， 各吸取 1mL分别接种于 3 管 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤36 145h48h接种 Baird-Parker 平板血浆凝固酶试验查 MPN 表报告结果图 3 金黄色葡萄球菌 MPN 法检验程序12. 操作步骤12.1 样品稀释依据进行。12.2 接种和培育12.2.1 依据对样品污染状况

15、的估量，挑选3 个相宜稀释度的样品匀液液体样品可包括原液，在进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL 样品匀液接种到 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3 管，将上述接种物于361培育 45h48h。12.2.2 用接种环从有细菌生长的各管中，移取1 环，分别接种 Baird-Parker 平板， 36 1培育 45h48h。12.3 典型菌落确认12.3.1 见12.3.2 从典型菌落中至少挑取 1 个菌落接种到 BHI 肉汤和养分琼脂斜面，361培育 18h24h。进行血浆凝固酶试验。13. 结果与报告运算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表见附录 C，报告

16、每gmL样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/gmL表示。可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结1. 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤1.1 成分附录 培育基和试剂可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结胰酪胨或胰蛋白胨植物蛋白胨或大豆蛋白胨17.0 g3.0 g氯化钠100.0 g磷酸氢二钾2.5 g丙酮酸钠葡萄糖10.0 g2.5 g蒸馏水1 000 mL1.2 制法将上述成分混合， 加热，轻轻搅拌并溶解， 调剂pH，分装，每瓶225mL，121 高压灭菌 15min。2. 7.5 %氯化钠肉汤。2.1 成分蛋白胨10.0 g牛肉膏5.0 g氯化钠75 g蒸馏水1 000

17、mL2.2 制法将上述成分加热溶解， pH，分装，每瓶 225mL，121高压蒸汽灭菌 15min。3. 血琼脂平板3.1 成分脑心浸液琼脂或胰蛋白大豆琼脂52g/40g兔血浆无菌 %柠檬酸钠：兔全血 =1:450mL100mL蒸馏水1000mL3.2 制法加热溶化琼脂，冷却至50 ，以无菌操作加入兔血浆，加热溶解，摇匀， 倾注平板。4. Baird-Parker平板4.1 成分Baird-Parker基础琼脂干粉63g蒸馏水1000mL4.2 制法称取Baird-Parker基础琼脂干粉 63g于1000mL蒸馏水中，加热溶解，调剂 ，高压蒸汽灭菌 15min。5. 脑心浸出液肉汤 BHI5.1 成分脑心浸出液肉汤 BHI 干粉37g蒸馏水1000mL5.2 制法称取脑心浸出液肉汤 BHI 干粉37g于1000mL蒸馏水中，调剂 ，高压蒸汽灭可编辑资料 - - - 欢迎下载精品名师归纳总结菌15min。6. 养分琼脂小斜面6.1 成分养分琼脂干粉23g蒸馏水1000mL6.2 制法称取23g养分琼脂干粉于 1000mL中，加热溶解，调剂，高压蒸汽灭菌 15min。7. 革兰氏染液BD革兰氏染液为成品，直接使用即可。参考文献：可编辑资料 - - - 欢迎下载