腺病毒介导基因治疗与病毒治疗前列腺癌的靶向研究进展.pdf

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1、现代泌尿外科杂志 2017年11月第22卷第11期综 述腺病毒介导基因治疗与病毒治疗前列腺癌的靶向研究进展蔡忠林1，刘强照1，周 川3，李 慧2，李文娟1，魏绪磐4，周逢海4(兰州大学第二医院：1泌尿外科，2神经外科，甘肃兰州 730000；3四川大学华西医院泌尿外科，四川成都610041；4兰州军区兰州总医院泌尿外科，甘肃兰州 730050)摘要：前列腺癌是老年男性高发性肿瘤疾病。运用雄激素去势治疗早期可以有效抑制肿瘤生长，但23年后大部分前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌，或晚期肿瘤发生转移，导致患者死亡。去势抵抗性前列腺癌及转移癌目前缺乏有效的治疗手段，腺病毒介导的基因治疗与病毒治疗是近年

2、来肿瘤治疗的热点，也是前列腺癌治疗的新方法。腺病毒在人体内的肿瘤靶向性是病毒发挥抗肿瘤作用及对人体安全性的关键环节。本文就目前在基础研究中有关腺病毒介导基因治疗与病毒治疗前列腺癌的靶向策略进行综述。关键词：基因治疗；病毒治疗；腺病毒；前列腺癌；靶向策略中图分类号：R73725 文献标志码：ADOI：103969jissn1009829t201711018前列腺癌是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤，近年来在我国发病率逐年上升，目前已成为我国泌尿系肿瘤的第3位】。早期前列腺癌以手术和去势治疗为主，但部分患者23年内不可避免地发展为去势抵抗性前列腺癌或发生肿瘤转移导致死亡。临床上对于晚期前列腺癌大多采用挽

3、救性治疗措施如内分泌治疗、化疗等，但临床效果欠佳。当现有临床治疗方法无法再抑制晚期前列腺癌发展时，腺病毒基因治疗与病毒治疗在基础实验中表现出良好的抑制肿瘤效果，因此其成为了近年来前列腺癌生物治疗的研究热点。在研究过程中，人们发现野生型腺病毒能够感染正常细胞而导致不可预测的细胞毒性，降低了人体应用的安全性。因此腺病毒肿瘤靶向性是其发挥抗肿瘤作用和保证人体应用安全性的首要前提。经过多年来的腺病毒研究，已经发展了多种增加前列腺癌靶向性的方法。本文将从腺病毒基因和病毒治疗的概念及腺病毒的肿瘤靶向策略两方面进行综述。1腺病毒基因治疗与病毒治疗腺病毒是一种线性无包膜的双链DNA病毒，其基因组编码区主要由E

4、1A、E1B、E2、E3、E4区组成，E1A、E1B与病毒自我复制能力有关，E3与宿主免疫逃逸有关2。腺病毒基因治疗利用复制缺陷型腺病毒，通过感染进目的细胞并表达其携带的外源基因而发挥基因治疗的作用。该病毒是利用基因工程的方法剔除了复制所需的E1A和E1B区，并将E3区剔除插入外源治疗基因而构建成的重组腺病毒。由于收稿日期：20161112 修回日期：2017-0312基金项目：兰州市人才创新创业项目(No2015-RC-16)通信作者：周逢海，主任医师，Email：Zhoufengh162corn作者简介：蔡忠林(1988一)，男(汉族)，硕士研究生主要从事泌尿外科临床工作及相关学术研究Em

5、ail：714833558qqcorn其缺乏复制能力，因此仅仅作为治疗基因的载体，通过治疗基因的表达而发挥抗肿瘤作用。研究中人们发现，缺乏复制能力的腺病毒限制自杀基因和矫正基因的治疗效果。为了解决这个问题，研究者们发展了腺病毒的病毒治疗方法，利用一种条件复制型腺病毒即溶瘤腺病毒来杀死肿瘤细胞。其利用基因工程的方法保留腺病毒自我复制所需的E1A区，与复制缺陷型腺病毒相比，除了可以通过插入E3区的外源治疗基因表达来发挥抗肿瘤作用外，其能通过自我复制并产生子代细胞导致肿瘤细胞破裂死亡，进而再感染周围的肿瘤细胞复制并使其破裂，还能通过产生毒性蛋白、激活宿主肿瘤免疫等作用协同发挥抗肿瘤作用嘲。2腺病毒的

6、肿瘤靶向策略21转录水平上的靶向策略部分生物分子在某些特定组织中表达或在正常细胞中低表达或不表达，而在肿瘤细胞中高表达，因此这些生物分子具有一定的组织或肿瘤特异性。将这些生物分子的基因启动子插入复制缺陷型腺病毒的治疗基因的上游或者插入条件复制型腺病毒的EIA上游，使得治疗基因的表达及条件复制型腺病毒的自我复制能力仅限于表达该生物分子的肿瘤细胞内，从而具有了肿瘤靶向性。前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)存在于前列腺导管上皮细胞和前列腺腺泡中，在正常前列腺组织和前列腺癌细胞中均有表达，因此具有组织特异性。CV706是最早携带PSA启动子的溶瘤腺病毒：在表

7、达PSA的前列腺癌细胞中自我复制；在不表达PSA的前列腺癌细胞系中，病毒的复制能力低，子代产量少4。复制缺陷型腺病毒Ad万方数据880 J Mod Ur01，V0122 No11 Nov2017PSAPGVl613G，通过PSA启动子表达调控B葡萄糖醛酸酶(13G)，能有效抑制PSA高表达的前列腺癌细胞系LNCaP的生长，移植瘤裸鼠模型中该腺病毒能够有效抑制肿瘤生长口。前列腺碱性蛋白(probasin，PB)属于lipocalin超家族(一种配体转运蛋白)，存在于前列腺上皮细胞和前列腺液中，具有组织特异性。TRUJILLO等凹1构建了带有PB启动子的溶瘤腺病毒Ad5PBRSVNIS，该腺病毒在

8、前列腺癌LnCaP中复制并产生细胞毒作用。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)主要存在于前列腺分泌腺泡上皮细胞和前列腺癌细胞，在前列腺癌及其转移癌中可高度表达，因此具有相对肿瘤特异性。GAO等73构建的带有PSMA启动子的腺病毒AdPSMAprohNIS感染进C81前列腺癌细胞后，显著表达其所携带的NIS基因。携带有PSMA增强子和启动子的腺病毒AdPSMA(EP)一CD与5氟胞嘧啶能有效杀死PSMA阳性的前列腺癌细胞(LNCaP和CL一1)_8J。PCA3基因(prostate cancergene 3，PCA3)属于长链非编码

9、RNA，在95以上的原发前列腺癌和转移癌标本中过表达，在其他人类正常组织未见明显表达凹。FAN等口叩构建的带有DD3KA3启动子的溶瘤腺病毒AdDD3一E1AIL一24能有效抑制前列腺癌细胞。MAO等nq构建的重组腺病毒AdDD3pEIA只在前列腺癌细胞LNCaP中表达E1A蛋白，而在正常前列腺上皮细胞和乳腺癌细胞中未见表达，证明了该启动子能使腺病毒具有肿瘤特异性。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)在正常组织中受到抑制，而在人类大多数肿瘤组织(包括前列腺癌)中重新被激活，因此具有肿瘤特异性。OBP一301是带有hTERT

10、启动子的溶瘤腺病毒1 2|，OBP一401为带有hTERT启动子并控制表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的溶瘤腺病毒口，在前列腺癌细胞中均表现出明显的抑制作用，进行LNCaP裸鼠移植瘤瘤内注射后，肿瘤组织免疫组化分析观察到高表达的EIA蛋白和扩散的溶瘤效果L1“。骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)与肿瘤的发生、发展有关，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等骨转移瘤组织中高表达1，因此具有肿瘤特异性。LI等口61构建的带有BSP启动子的腺病毒AdBSPEla，感染前列腺癌C42B细胞后细胞生长受到显著的抑制。皮下移植瘤模型中，肿

11、瘤生长也受到该病毒显著的抑制。人类激肽释放酶2(human kallikrein 2，hK2)主要由前列腺上皮细胞产生，其在乳房、卵巢、睾丸等组织中有少量表达，但在前列腺组织中，尤其在PSA阴性的前列腺肿瘤中均有hK2蛋白的表达1。溶瘤腺病毒CV763带有hK2启动子，能在前列腺癌细胞中大量复制子代病毒并能有效杀伤前列腺肿瘤细胞、抑制肿瘤生长1 8I。22转导水平上的靶向策略腺病毒感染细胞依赖病毒表面衣壳蛋白与细胞表面相应受体结合。目前研究中常用的C组5型腺病毒是通过与肿瘤细胞表面柯萨奇腺病毒受体(coxsackie and adenovirus receptor，cAR)结合而感染肿瘤细胞，

12、但是部分肿瘤细胞如胰腺癌、卵巢癌、胃肠癌、去势抵抗性前列腺癌等CAR的水平常常缺失或低下1 9|。改变腺病毒衣壳蛋白对应的肿瘤细胞表面受体的取向，提高腺病毒的转导靶向效率，可以尽可能大地减少病毒用量，最大程度地降低病毒的免疫原性和毒性。大部分肿瘤细胞表面存在CD46蛋白，B亚型腺病毒可以与之结合并感染肿瘤细胞2。SANDBERG等2妇在B亚群11型腺病毒基础上构建溶瘤腺病毒，并将其感染前列腺癌3种细胞系(LNCaP、DUl45、PC一3)，结果显示其在CAR缺乏的DUl45和PC3细胞的转导效率显著提高，PC3移植瘤模型中也观察到明显抑制肿瘤细胞的生长。利用精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(RGD)肽

13、链掺人5型腺病毒纤维蛋白HI环中，使腺病毒通过识别细胞表面广泛存在的整合素avB3或0【vp5感染细胞。SUZUKI等223构建了经过RGD纤维修饰的溶瘤腺病毒AdSA24RGD，与不含RGD肽链的Ad5一A24相比，能够显著增加感染LNCaP前列腺癌细胞的能力并产生杀伤效果。利用不同类型腺病毒纤维蛋白的融合构建成嵌合溶瘤腺病毒(chimaeric adenovirus)，可以改变5型腺病毒的取向，增强转导靶向性，从而提高5型腺病毒感染肿瘤细胞的效率。AZAB等2胡将3型腺病毒的纤维蛋白(fiber knob)替代5型腺病毒的纤维蛋白，组成嵌合型溶瘤病毒Ad53-CTV，实验结果显示Ad53一

14、CTV在CAR非依赖型的前列腺癌细胞中更有利于病毒的感染，而且移植瘤模型中能更有效地抑制肿瘤细胞活性。腺病毒3受体被报道在肿瘤细胞中高度表达，因此Ad53使该嵌合腺病毒不再依赖CAR受体，转为靶向腺病毒3受体，因此能够特异性地感染CAR阴性肿瘤细胞，间接提高感染效率m。23 多种靶向策略的联合应用 随着对腺病毒肿瘤靶向策略的研究，人们发现每种靶向策略均有各自的不足，如转录水平上的靶向策略存在：部分特异性启动子转录活性低；受到腺病毒转导效率的限制；特异性生物分子在同一肿瘤不同阶段的表达水平差异较大，限制了腺病毒在该种肿瘤中的应用等等。万方数据现代泌尿外科杂志 2017年11月第22卷第11期 8

15、81转导水平上的靶向策略尽管可以改变腺病毒结合目的细胞的受体种类提高了转导效率，但是往往更换的受体在正常细胞中表达水平不低，腺病毒同样可以引起毒性。因此研究者将不同水平上或同种水平不同靶向策略联合应用来弥补各水平上靶向策略的不足，以此增强腺病毒的靶向性。多种特异性启动子或增强子联合应用，以提高肿瘤的靶向性，是常用的一种策略。LEE等3构建的带有PSMA启动子和PSMA增强子的复制缺陷型腺病毒AdPSESluc在PSA和PSMA阳性的前列腺癌中观察到显著的luc荧光蛋白高表达。由PSA增强子、PSMA增强子、TARP启动子构建的重组腺病毒Ad-IPPTLuc能有效感染激素敏感性和激素耐受型的前列

16、腺癌细胞，其对应的溶瘤腺病毒AdEIPPTEIA有显著的溶瘤效果嵋6|。PSA增强子和PB启动子联合构建新腺病毒质粒Ad5一PSA74一Pb4一EC，EC报告基因证实该腺病毒在前列腺癌细胞中的复制具有显著特异性。转录水平和转导水平联合应用，不仅可以提高转导效率而且可以提高靶向水平，充分发挥腺病毒的抗肿瘤作用。KIM等273将转导水平上的纤维蛋白嵌合策略与特异性启动子策略相结合构建了溶瘤腺病毒Ad535PSESmRFPttk，实验结果证实其在激素非依赖型的前列腺癌细胞中高水平复制而且发挥显著的杀伤作用。总之，腺病毒的靶向性是腺病毒介导的基因治疗和病毒治疗肿瘤的关键。现有的靶向策略在基础研究中已经

17、取得了很大的发展。小部分重组腺病毒如H101、dll520、OCaPl、Delta一24一RGD、OBP702、SG600一p53、Adp53、CRAdp53等在不同国家中进行工期临床实验2 8I。其中HIOI(安柯瑞)是首个在中国批准应用于人体溶瘤腺病毒，也是世界首个，在晚期肿瘤治疗中具有一定的治疗效果。但由于应用于人体还存在病毒免疫原性、药代动力学、组织器官靶向性等相关影响因素的存在，大部分重组腺病毒还停滞于基础实验阶段。因此，除了腺病毒靶向性的深入研究之外，还需要科研人员在其他人体应用方面更加深入研究，以提高人体的安全性和有效性，使得腺病毒的基因和病毒治疗取得最大化的净效益，为下一步应用

18、于临床打下坚实的基础。参考文献：1TONRY C，ARMSTRONG J，PENNINGTON SRProbing theprostate tumour microenvironment I：impact of glucose deprivation on a cell model of prostate cancer progressionJOncotarget，2017，doi：1018632onc。target146052HAWKINSON DJ，ISON MGRespiratory viruses：influenza，RSV，and adenovirus in kidney trans

19、plantationJSemin Nephrol，2016，36(5)：417-4273KUMAR R，BASAGOUDANAVAR SH，SREENIVASA BPDetection of replication competent adenovirus upon serial passaging of recombinant adenovirus expressing FMDV capsid proteinsJBiologicals，2015，43(3)：2092124CHEN Y，DEWEESE T，DILLEY J，et a1CV706，a prostatecancer specifi

20、c adenovirus variant，in combination with radiotherapy produces synergistic antitumor efficacy without increasing toxicityJCancer Res，2001，6l(14)：54535460EsWANG L，DONG J，wEI M，et a1Selective and augmented beta。glucuronidase expression combined with DOX-GA3 applicationelicits the potent suppression of

21、 prostate cancerJOncol Rep，2016，35(3)：1417 14246TRUJILLO MA，ONEAL MJ，MCDONOUGH S，et a1A probasin promoter，conditionally replicating adenovirus that expresses the sodium iodide symporter(NIS)for radi。virotherapy ofprostate cancer EJGene Ther，2010，17(11)：132513327GAG XF，ZHOU T，CHEN GH，et a1Radioiodine

22、 therapy forcastrationresistant prostate cancer following prostatespecificmembrane antigen promoter-mediated transfer of the human sodium iodide symporter EJAsian J Androl，2014，16(1)：1201238ZENG H，WEI Q，HUANG R，et a1Recombinant adenovirusmediated prostatespecific enzyme prodrug gene therapy regulate

23、d by prostatespecific membrane antigen(PSMA)enhancerpromoter口J Androl，2007，28(6)：827835E9GREENE DJ，ELSHAFEI A，NYAME YA，et a1External validation of a PCA-3-based nomogram for predicting prostate cane-er and highgrade cancer on initial prostate biopsyJProstate2016 Aug；76(11)：1019-1023DoFANJK，WEI N，DIN

24、G M，et a1Targeting GeneViroTherapyfor prostate cancer by DD3driven oncolytic virusharboring in-terleukin一24 geneJInt J Cancer，2010，127(3)：70771711MAO LJ，ZHENG JN，LI W，et a1Construction of an oncolyticadenovirus expressing small hairpin RNA and targeting theSATBl geneJZhonghua Nan Ke Xue，2010，16(8)：6

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27、万方数据892 J Mod Urol，V0122 No11 Nov2017注的安全压30 mmHg(1 mmHg一0133 kPa)。术后1 d肛门排气，精神状况良好，可流质饮食，肾造瘘管引出淡红色尿液，无发热、畏寒、大出血等并发症发生；术后3 d复查腹部正位平片未见明显残石(图1B)。术后7 d拔除肾造瘘管，未见明显出血；术后8d拔除尿管，术后9 d顺利出院。2讨 论综合分析本病例，该患者曾患有严重的心肺疾病，铸型结石，手术难度大、风险高，若行传统俯卧位PNCL，极有可能诱发患者严重心肺疾病，遂采取“腰肋悬空”仰卧位，有效避免了俯卧位使患者胸腹受压带来的风险，术后复查基本元结石残留，工期取石

28、干净，手术安全有效。张林林等H1研究认为，标准PCNL具有手术时间短、清石效率高及感染率低的优点，临床效果优于微通道经皮肾镜，有研究表明标准通道能有效避免术中肾盂高压，减少手术并发症发生口。“腰肋悬空”仰卧位操作的优点有：手术体位摆(上接第881页)15ANUNOBI CC，KOII K，SAXENA G，et a1Expression of theSIBI。INGs and their MMP partners in human benign and matignant prostate neoplasmsJOncotarget，201 6，doi：1018632oneotarget1011

29、016LI Y，KACKA M，THOMPSON M，et a1Conditionally replicating adenovirus therapy utilizing bone sialoprotein promoter(AdBSP-E1a)in an in vivo study of treating androgen independentintraosseous prostate cancer口Urol Oncol，20ll，29(6)：6243317MATTSSON JM，RAVELA S，HEKIM C，el atProteolytic activity of prostate

30、specific antigen(PSA)towards protein substrates and effect of peptides stimulating PSA activityJPLoSONE，2014，9(9)：e10781 9r 1 8YU DC，SAKAMOTO GT，HENDERSON DRIdentification ofthe transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2and their use in the construction of calydon virus 764，an attenu

31、ated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy口Cancer Res，1999，59(7)：1498 150419YAMAMOTO MConditionally replicative adenovirus for gastrointestinal cancers EJExpert Opin Biol Ther，2004，4(4)：1241125020CHO YS，DO MH，KWON SY，et a1Efficacy of CD46一targeting chimeric Ad535 adenoviral ge

32、ne therapy for colorectal caneers EJoncotarget，2016，7(25)：38210382232 1SANDBERG L，PAPAREDDY P，SILVER J，et a1Replication一放简单；对患者血流动力学影响较小；肠管向中线移位，减少肠管损伤几率；穿刺通道与水平夹角小，结石易于冲出等。该病例较好地体现了“腰肋悬空”仰卧位PCNL的优点。参考文献：Eli周向文，黄冬梅泌尿系结石的治疗进展J，中国误诊学杂志，2010，10(15)：3546-3547E2谷现恩，梁丽莉，安瑞华，等尿石症的诊断与治疗M北京：人民卫生出版社，2008：2792

33、82r3FALAHATKAR S，ALLAHKHAH A，SOLTANIPOUR SSupine pereutaneousnephrolithotomy：profJJ Urol，2011，8(4)：2572644张林林，吴卫真，朱李兵，等标准通道与微通道经皮肾镜治疗感染性肾结石的对比研究J临床外科杂志，2011，2(19)：121-124E5潘铁军，谢旭敏，李功成不同口径通道经皮肾镜取石术与术后感染的相关性研究J现代泌尿外科杂志，2015，20(3)：147 150(编辑何宏灵)competent AdllP vector(RCAdllp)efficiently transduces andr

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35、tate cancergene transfer and therapy using a novel serotype chimera cancerterminator virus(Ad53 CTV)EJJ Cell Physiol，2014，229(1)：344324ONEAL MJ，TRUJILLO MA，DAVYDOVA J，et a1Effect ofincreased viral replication and infectivity enhancement on radioiodide uptake and oncolytic activity of adenovirus vect

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