喉癌细胞hTERT启动子介导基因治疗研究.pdf

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1、生墼煎匿堂皇堕笙鲎查!堕生!旦整望鲞矍!塑至坐堂堂麴堕!垒匹；哑!型丝!坠：；喉癌细胞hTERT启动子介导基因治疗研究廖正凯周云峰周福祥 骆志国 熊杰 鲍洁 谢丛华 刘诗权【摘要l 目的 研究喉癌细胞中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶(hTERT)表达和hTERT启动子活性的关系，以及hTERT启动子介导喉癌基因治疗的可行性。方法 将含hTERT启动子的质粒转染不同放射敏感性喉癌细胞(Hep2和Hep2R)，通过报告基因评价启动子活性，RT-PCR检测hTERTmRNA表达，PGRELISA法检测端粒酶活性。构建质粒phTERTp-HRP，用RT-PCR和酶活性分析评价辣根过氧化物酶(nRP)表达，

2、以克隆形成实验评价phTERTp-HRPPjI哚乙酸(I从)对克隆形成率和放射敏感性的影响。结果Hep2R的端糙酶活性、hTERTmRNA表达水平和hTERT启动子活性分别是Hep2的1，37、143和181倍。hTERT启动子活性与hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性之间显著正相关(P005)。说明hTERT启动子在Hep2细胞中活性较弱，不足以启动足够的HRP表达。结果进一步说明端粒酶活性高的Hep2R细胞中hTERT启动子具有更高的活性。5phTERTpHRPIAA的放射增敏作用：如图3所示，拟合存活曲线显示Hep2和Hep2R细胞瞬时转染质粒phTEBTpHRP后，姒孵育的放射增敏

3、比SERsr分别为 和24；无I从组,和有I从1组20存活1曲线的参数a分别为o042、0099(Hep2)和O020、O090(Hep2R)。表明I从孵育对转染后的Hep2和Hep2R细胞均有放射增敏作用。讨 论喉癌是头颈部较常见的恶性肿瘤之一。喉切除术是治疗喉癌的主要手段，但术后对患者的生活质量会产生较大影响5。细胞的放射敏感性是决定放疗疗效的重要因素，提高细胞的放射敏感性和采用有效的杀伤机制是克服放射耐受的有效途径。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，能够将端粒重复序列添加到端粒末端。端粒酶在超过85的肿瘤细胞中具有高活性，而在绝大多数正常细胞中被抑制或不表达哺】。hTERT是端粒酶活性的主要

4、决定因素J。研究发现，端粒酶活性和hTERT表达升高是喉癌发生的重要特征191。端粒酶活性可作为喉癌的早期诊断和预后指标u“。研究发现，端粒酶长度与放射敏感性有关，放射耐受株具有更高的端粒酶活性。因此，可以利用喉癌细胞内端粒酶活性特征，运用hTERT启动子调控治疗基因在喉癌细胞中特异性的表达。实验结果显示，喉癌细胞内hTERT启动子与端粒酶活性和hTERT mRNA表达水平明显正相关。提示hTERT启动子活性可以反映喉癌细胞与正常喉组织细胞之间，以及不同放射敏感性喉癌细胞之间端粒酶活性的差异。hTERT启动子携带治疗基因有望实现针对喉癌细胞的靶向基因治疗，尤其对耐放射喉癌细胞具有更明显的疗效。

5、图3 Hep2和Hep2R细胞中phTERTp-HRPIAA的放射增敏作用基因导向性酶前体药物疗法(genedirected enzymeprodrugtherapy，GDEPT)，亦称自杀基因疗法，是目前基因治疗领域研究的热点。其原理为：当基因在肿瘤细胞中表达时，可将全身给药的无毒性或毒性极低的药物前体转变成毒性代谢产物，在肿瘤万方数据堡丝盟堕堂皇堕塑盘查!塑生兰旦箜望鲞箜!塑垦坚!型!丛塑堕!叁P鲤!塑!塑!丝!盥!：；局部杀伤肿瘤细胞，避免全身或局部直接给药的副作用。人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)丙氧鸟苷(GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶基因氟胞嘧啶(CD5FC)自杀基因系统都是被广泛研

6、究的自杀基因治疗体系。HRPIAA系统是新一代前药系统，与经典的HSVTKGCV系统相比，具有更加快速和高效的肿瘤细胞杀伤作用1。无毒的HRPIAA系统显示出不依赖于细胞连接的细胞毒性和旁观者效应，在极端的肿瘤细胞缺氧条件下甚至更加高效，而且它能够有效地增强肿瘤细胞的放射敏感性H1112】。因此，HRPIAA系统是一种理想的基因治疗方案。虽然目前对其机制尚无定论引，但研究显示HRP与IAA反应过程中产生的多种自由基(包括吲哚、3甲基吲哚、过氧化物等自由基)以及活性氧(ROS)(包括町和H20：)与该系统的细胞毒性和放射增敏效果有关H刮。HRP基因在肿瘤细胞中特异性表达是HRPIAA系统发挥优势

7、的关键。本研究构建了真核表达载体phTERTpHRP，转染后Hep2R内HRP的表达明显高于Hep2细胞，说明hTERT启动子可以依据细胞内端粒酶活性调控HRP的表达。虽然hTERT启动子活性较弱，但IAA孵育后Hep2R和Hep2细胞的SERs，分别为124和Z120，而采用GDEPT处理细胞后SER值达到12，说明放疗疗效得到明显增强引。一方面说明高效的HRPIAA系统可以弥补hTERT启动子活性的不足，尤其与射线联合使用时，是实现特异性和高效性的理想组合。提示如果通过某种技术增强hTERT启动子的活性和(或)载体的转染效率，导致细胞内HRP表达增多，可能实现更加明显的杀伤和增敏效果。另一

8、方面说明射线对Hep2和Hep2R细胞中hTERT启动子活性可能存在不同程度的影响，导致Hep2细胞中HRP表达量增幅较大，表现为射线处理后Hep2和Hep2R细胞的SER达到相似水平。由于多种肿瘤细胞的放射抗株都表现出升高的端粒酶活性，hTERTpHRPIAA可能应用于这些肿瘤中耐放射细胞的基因治疗，作为放疗的有效补充，具有广阔的前景。综上所述，hTERT启动子介导的基因治疗适用于喉癌的靶向基因治疗，phTERTp。HRPIAA可以针对端粒酶阳性的、尤其是放射耐受的喉癌细胞发挥细胞毒性和放射增敏作用。hTERTpHRPIAA基因治疗在其他肿瘤中的治疗作用，以及如何在保持特异性的情况下提高hT

9、ERT启动子的活性，都值得进一步研究。参 考 文 献骆志国，周福祥，周云峰，等鳞癌细胞株放射敏感性与端粒酶活性及端粒长度变化的关系中华放射医学与防护杂志，2005，25(3)：232235Hofikawa I，Cable PL，Mazur SJ，et a1Downstream Ebox-mediatedregulation of the human telomerase reverse transeriptsSe(hTERT)gene transcription：evidence for fill endogenous mechanism oftranscripfional repressio

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