微生物限度方法学验证方案.docx

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1、微生物限度方法学验证方案 微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P- 批准签字页 目录 1.目的 (4) 2.范围 (4) 3.责任者及职责 (4) 4.验证简介 (4) 5验证过程 (7) 6结果判断 (8) 7结论和建议 (8) 8异常情况报告 (8) 9再验证 (8) 10附件 (8) 附件1：培养基的灵敏度复核 (9) 附件2：稀释液的无菌性检查 (10) 附件3：方法验证 (11) 1. 目的 按照中国药典2022版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。2. 范围 本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。 3. 责任者及职

2、责 4. 验证简介 4.1 定义 CFU：菌落数 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。 试验组 当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。 菌液组 测定所加的试验菌数。 稀释剂对照组 用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。 4.2 菌悬液 4.2.1菌种及来源 检查人：复核人：检查日期： 4.2.2菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，3035培养1824h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼

3、脂培养基上，2025培养2448h。上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50100CFU的菌悬液。 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，2328培养57天，加入35ml含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含 0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100CFU的孢子溶液。 4.3 培养基及稀释液 4.3.1培养基和稀释液的名称 培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水 4.3.2培养基灵

4、敏度复核 培养基灵敏度复核，参见培养基的灵敏度检查操作规程QC252 4.3.3稀释液的无菌性检查 对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。此操作可与其它试验同时进行。 4.4 供试液的预处理 4.4.1样品名称及数量 检查人：复核人：检查日期： 4.4.2样品预处理方法 *中间制品 无需处理，取原样品50ml作为供试液。 *成品 无需处理，取原样品50ml作为供试液。 原辅料1 取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用； 原辅料2 取10g样品，加入灭菌后的PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用； 原辅料. 取10g样品，加入灭菌后的

5、PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用； 消毒剂（*）按照比例进行配制。 取1ml样品，加入灭菌后的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,混匀待用。 饮用水 取1ml样品，加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。 纯水制备过程水 取1ml样品，加入灭菌后的纯化水至100ml,混匀待用。 4.5 实验用品 *滤膜材质为混合纤维素酯。 4.6 参考文件 4.6.1 中国药典2022版第三部附录XIIG- 微生物限度检查法 4.6.2验证管理规程 4.6.3超标数据调查及处理管理规程 4.6.4异常情况管理规程 4.6.5培养基管理规程 4.6.6薄膜过滤法无菌检查操作规程 4.6

6、.7培养基的灵敏度检查操作规程 4.6.8菌种复苏、传代及菌悬液制备操作规程 4.6.9微生物限度检查操作规程 4.6.10消毒剂微生物污染水平检测操作规程 5验证过程 5.1试验次数：验证试验应进行3次独立平行实验 5.2试验器具准备 试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品、无菌滤膜和无菌滤杯一同放入无菌室的传递厨内。 用消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。 5.3 测定 5.3.1 按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。 5.3.2 用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。 5.3.3在无菌环境下，取4.2.2项

7、下配制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50100CFU，分别注入 无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30-35培养2天，计数；取4.2.2项下配制的白色念珠菌、黑曲霉各50100CFU，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼 脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23-28培养3天，计数；以上作为菌液组。 5.3.4 在无菌环境下，将过滤设备安装完毕。 5.3.5 取适量稀释液倒入滤杯中，待滤膜润湿后进行以下操作。 5.3.6 将规定量的样品加入过滤器内（滤膜d47mm ；0.45m ），减压过滤。滤后，加100mlpH7.

8、0氯化钠蛋白胨 缓冲液冲洗滤膜，重复n 次（初步设定为3次，如需增加冲洗量可以适当增加冲洗次数，每次100ml ，但总冲洗量不得超过1000ml ），在最后一次的稀释液当中加入4.2.2项下配制的菌液，作为试验组，平行操作一次。 5.3.7 不加入菌液重复5.3.4-5.3.6，作为供试品对照组。 5.3.8 只加入稀释液和4.2.2项下配制的菌液作为稀释剂对照组。 5.3.9 无菌操作取出滤膜，按下表加入对应培养基上，营养琼脂培养基 30-35培养2天后观察，玫瑰红钠培养基 23-28培养3天后观察。 5.3.10 以上表中所选的菌按照5.3.2-5.3.9重复操作。 6 结果判断 在三次独

9、立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率K1（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数 的百分率）应均不低于70%，试验组的菌落数回收率K2(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%。 稀释剂对照组的菌数回收率K1= 菌液组 稀释剂对照组 C C 100% 试验组的菌落数回收率K2= 菌液组 供试液对照组 试验组C C C -100% 7 结论和建议 此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论，有异议的将给出建议。 8 异常情况报告 对验证中发现的任何异常/不合格情况应按照异常情况管理规程执行。 9 再验证 如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。 10附件 10.1附件1 培养基灵敏度检查记录 10.2附件2 薄膜过滤法无菌检查记录 10.3附件3 微生物方法学验证记录 10.4附件4 培养基厂家报告 附件1：培养基的灵敏度复核 复核人：操作人： 附件2：稀释液的无菌性检查 复核人：检验人： 附件3：方法验证 样品名称：培养基： 试验菌名称：菌种批号： 3批样品按顺序进行3次试验 复核人：操作人：