关节软骨损伤基因治疗的研究进展.pdf

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1、关节软骨损伤基因治疗的研究进展白洁玉杨自权关节软骨是一种特殊分化的结缔组织，由软骨细胞、软骨基质及埋藏于基质中的胶原纤维共同组成。由于关节软骨本身缺乏血管组织受损后人体的自愈能力有限，所以由疾病以及外伤导致的软骨损伤往往造成严重的后果，如致畸、致残和行动受限等。目前，常用的软骨修复方法如外科手术，其效果并不令人满意。并不能使关节功能完全恢复。随着组织工程技术的发展，基因治疗引起了人们的重视，为软骨损伤修复带来了新的希望。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿由于基因缺陷或异常引起的疾病。软骨损伤的基因治疗就是通过基因转移技术将目的基因插入患者适当的靶细胞中，使目的基因表达的产物能促进

2、靶细胞向软骨细胞分化及软骨特异性细胞外基质的合成，从而达到治疗目的。基因治疗关节软骨损伤是目前的新兴课题，涉及目的基因、靶细胞、载体及基因转染方式的选择等许多具体问题本文就此做一综述。1目的基因的选择目的基因是指基因治疗中研究者感兴趣的基因或DNA序列。通过以下几种方式获得：已知目的基因序列的前提下，利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因序列：(萤cDNA文库以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成eDNA再复制成双链eDNA片段；采用聚合酶链反应获取目的基因；基因组DNA文库分离组织或细胞染色体DNA利用限制性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有目的基因。在关节软

3、骨损伤基因治疗中，常用的目的基因有以下几种。1j1胰岛素样生长因子(IGF)基因：IGF具有刺激软骨细胞增殖并合成软骨基质维持软骨细胞表型的作用。Orth等23将经IGF1基因和成纤维细胞生长基金项目：国家自然科学基金(30973048)作者单位：030001太原。山西医科大学第二医院骨科通信作者：杨自权因子(FGF)一2基因共修饰的兔关节软骨细胞回植入兔膝关节软骨缺损区，实验发现经IGF1基因和FGF一2基因共修饰的兔关节软骨细胞促进软骨缺损区的修复，而且阻止了缺损邻近软骨的进一步退变。IGF一1基因转染兔软骨细胞，然后将经基因修饰的兔软骨细胞回植入软骨损伤模型中，结果发现IGF-1表达量持

4、续增加，且对软骨组织的再生有一定的促进作用。之后检测糖胺多糖的量同样发现新生软骨细胞中糖胺多糖的量比其邻近软骨细胞中的量要高3。12转化生长因子(TGF)基因：TGF一13具有促进软骨损伤修复及维持软骨细胞表型特征的作用。LoeserE4认为，TGF13，可以促进细胞表面受体整合素的表达，并通过增强靶细胞合成和分泌软骨特异性细胞外基质即型胶原的能力来促进软骨损伤的修复。Lee等跚用TGF13，基因转染兔成纤维细胞然后将经基因修饰的成纤维细胞回植入膝关节软骨缺损区，46周后发现新生的透明软骨组织将软骨缺损区域完全填充。13骨形态发生蛋白(BMP)基因：BMP能够诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)

5、不可逆地分化为软骨细胞，并对关节软骨损伤修复有促进作用。Hidaka等s在体外用腺病毒载体介导BMP一7基因转染软骨细胞，发现细胞外基质中型胶原和糖胺多糖的含量增加，而且体外形成的软骨组织也变厚。Sekiya等，用含有TGF13。和地塞米松的诱导软骨细胞生成的培养液诱导健康成人BMSCs，通过加或不加BMP一2,-4或6将其分成6组，培养21 d后对各组进行分析。经免疫组织化学和对所合成软骨大小及质量的分析发现，BMP2、一4或6、4和一6都有促进BMSCs向软骨分化的作用，但是BMP2作用最强。14 Sox9基因：Sox9基因是Sox基因家族的一个重要成员，作为转录调控因子，是软骨形成过程中

6、不可缺少的关键因子。Konishi等8对11例软骨黏液样纤维瘤和10例成软骨细胞瘤标本进行组织学染色，实验发现软骨黏液样纤维瘤组有10例Sox9阳性和帅论万方数据8例型胶原阳性在成软骨细胞瘤组也有8例Sox9阳性和7例型胶原阳性。结果提示Sox9可能与软骨黏液样纤维瘤和成软骨细胞瘤的成软骨特性有关。杨自权等，实验证明，经Sox9基因修饰的BMSCs可以稳定表达软骨特异性标志物。2靶细胞的选择21 BMSCs：BMSCs存在于骨髓组织中，来源丰富，采集方便，易分离扩增，无免疫原性，对机体损伤小，并具备多系分化潜能；而且与胚胎干细胞相比，其在使用方面不存在伦理学问题。所以成为软骨修复中理想的靶细胞

7、。Park等1101经脂质体介导将TGFB，基因转染入兔BMSCs，发现软骨特异性细胞外基质的含量增加。之后将经基因修饰的BMSCs放在壳聚糖支架上移植入兔膝关节软骨缺损区12周后缺损处发现有新生透明样软骨组织覆盖。22软骨细胞：软骨细胞具有软骨修复功能而且取材方便，易被转染，免疫原性低。Tew等E11用携带Sox9基因的逆转录病毒转染去分化的人软骨细胞结果发现去分化的软骨细胞重新开始表达软骨特异性标志物。但是人体软骨细胞供应不足，而且经过长期体外培养后容易出现去分化现象12。即使将软骨细胞回植入已发生病理改变的软骨损伤区也不能维持其特有的表型特征而易发生变性。23脂肪干细胞(ADSCs)：A

8、DSCs具有向软骨细胞方向分化的能力。Zuk等”证实了脂肪组织中含有向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化的多能干细胞，即ADSCs。目前，ADSCs的软骨分化潜能也已得到了广泛的证实。因其体内分布广，取材容易，创伤小，细胞获得量大，是一种理想的靶细胞。Yoon等14在透明质酸支架中培养ADSCs。同时加入BMP2进行诱导，通过细胞形态的观察及糖胺多糖含量的检测证实ADSCs分化为软骨细胞。3载体的选择31脂质体：脂质体转染法的使用在软骨损伤基因治疗中较常见。脂质体制备简单，价格便宜，无免疫原性，毒性小、安全，能在活体内应用。它可以通过多聚碳酸脂滤膜消毒灭菌用它包装的DNA可在4下长期保存而不失活

9、性，且包装容量大，又可保护DNA免受核酸酶的降解。Tsuchiya等15用脂质体介导Sox9基因转染小鼠BMSCs。在体外培养经筛选后的阳性细胞2周，然后将其移植入体内。移植4周后肉眼观察发现形成一直径2 mm的软骨组织块经组织学及免疫组织化学检测到型胶原蛋白表达阳性。其缺陷是转染效率过低，文献16报道脂质体介导的基因转染BMSCs的转染效率仅为l-24。32慢病毒：慢病毒载体是由人类免疫缺陷病毒(HIV)经过人工基因改造后形成的。慢病毒中的毒性基因已经被外源性基因所替代。属于假型病毒。慢病毒属于一种反转录病毒在细胞内能以RNA为模板，在自身反转录酶的作用下反转录为cDNA，再以cDNA为模板

10、形成双链DNA。最后整合在靶细胞的染色体上并持续表达。慢病毒载体能够感染处于分裂期或非分裂期的细胞目的基因可在靶细胞中长期稳定表达。而且具有携带基因片段容量大、转染效率较高等诸多优点，现已成为软骨损伤基因治疗中转染目的基因的理想载体。Miot等17用载有绿荧光蛋白的慢病毒载体转染羊关节软骨细胞。然后移植入羊软骨损伤模型以追踪软骨的整个修复过程。然而慢病毒载体也存在一些潜在的危险，它具有致突变性，可能会对靶细胞造成不良的影响。如果将载体整合到一些特定的部位。可能会引起基因突变或激活某种致病基因而引起难以预测的严重后果。33腺病毒：腺病毒属于DNA病毒。腺病毒载体安全性好、易复制、操作简单，重组腺

11、病毒载体有较高的滴度，容量较大，相对稳定、经得起纯化、浓缩。Ikeda等18用腺病毒介导Sox5、Sox6、Sox9基因同时转染小鼠胚胎干细胞、入BMSCs、人表皮成纤维细胞等多种细胞，结果发现所有细胞内软骨特异性基因表达均明显升高。体外转染实验证实，重组hTGFp。腺病毒转染BMSCs能获得hTGFB。蛋白表达，并且应用重组hTGFB，腺病毒转染BMSCs进行微团诱导培养，可诱导部分BMSCs向软骨细胞分化悖。但是腺病毒的缺陷是不能将外源目的基因整合到染色体中，不能使目的基因在体内长期稳定表达。4转染方式的选择41体内转染：体内转染是将携带有目的基因的载体直接注入机体内，被吸收后目的基因在机

12、体的细胞内进行复制和表达。这种转染方式操作简单。且对机体的损伤较小。但是由于软骨细胞被周围厚厚的基质围绕，导入的基因难以到达软骨细胞，这种方法也不能提供修复的靶细胞。而且病毒载体的安全性尚不清楚。因此限制了体内转染方式在基因治疗方面的运用。42体外转染：体外转染是将携带有目的基因的载万方数据主垦堑堕堕壅!Q!；生!旦箜!鲞筮!塑鱼!i!坚垦!堡!垒i!垒g!i!i!：墅P!坐竺兰Q!兰：Y生：!圣：塑!：!体转入体外培养的细胞内，将已转染的细胞经过单层或立体培养扩增或分化后回植入机体内继续生长。这种方式尽管比较复杂，但可以保证机体的安全性。Gelse等认为，基因经过体外转染的方式迸入机体后能够

13、大量表达基因产物。体外转染的缺点是操作复杂、费时长、花费高，并且存在异体移植的问题。但是体外转染方式能够提供大量种子细胞，这对于各种软骨损伤的治疗具有很重大的意义。综上所述。(1)Sox9是多种生长因子诱导软骨分化过程中的关键环节，所以Sox9基因是一个比较理想的目的基因。(至)BMSCs来源丰富，采集方便，易分离培养，无免疫原性，且具有多系分化潜能，因而成为软骨组织工程重要的种子细胞。新一代慢病毒载体为自杀性病毒，即病毒转染靶细胞后不会再转染其他细胞也不会利用靶细胞产生新的病毒颗粒。不仅转染效率令人满意，而且安全性比较可靠。关节软骨损伤机制和目的基因表达在转录和转录后水平上的调控机制有待明确

14、，目前microRNA和iRNA成为该方向研究的热点。最后随着组织工程技术及分子生物学的快速发展，软骨损伤的基因治疗也会获得重大的进展。参考文献1Griffith LG，Nanshton GTissue engineering：current challengesand expanding opportunitiesScience，2002，295：100910142Orth P，Kaul G，Cucchiarini M，et a1Transplanted articularchandrocytes co-overexpressing IGFI and FGF一2 stimulate cart

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