人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究.pdf

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1、书书书基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （ !#$%!&%）作 者 单 位 ： #%# 济 南 ， 山 东 大 学 齐 鲁 医 院 妇 产 科 孔 北 华 、 宋 悦 （ 现 在 中 国 医 学 科 学 院 中 国 协 和 医 科 大 学 北 京协 和 医 院 妇 产 科 %$!） 、 曲 迅 、 江 森 ， 肿 瘤 防 治 中 心 血 液 病 研 究 室 （ 马 道 新 ） 论 著 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 启 动 子 调 控 下 胞 嘧 啶脱 氨 酶 (胸 苷 激 酶 融 合 基 因 治 疗卵 巢 癌 的 体 外 研 究孔 北 华 ) 宋 悦 ) 马

2、 道 新 ) 曲 迅 ) 江 森) ) 【 摘 要 】 ) 目 的 ) 探 讨 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 （ *+,-+） 启 动 子 调 控 下 的 融 合 双 自 杀 基 因 胞 嘧 啶脱 氨 酶 (胸 苷 激 酶 .(氟 胞 嘧 啶 / 更 昔 洛 韦 （ 01(+2.(30 / 405） 系 统 对 人 卵 巢 癌 细 胞 及 正 常 细 胞 的 体外 杀 伤 作 用 。 方 法 ) 应 用 脂 质 体 转 染 法 将 *+,-+ 核 心 启 动 子 报 告 质 粒 67+89:(#$; 转 染 人 卵 巢 癌 细胞 系 !=,0） 和 人 胚 肺 成 纤 维 细 胞 株 ?,3

3、， 用 荧 光 素 酶 分 析 检 测 *+,-+ 启动 子 活 性 ； 应 用 -+(A0- 技 术 检 测 *+,-+ B-=,0 细 胞 中 01 和 +2 基 因 的 表 达 情 况 。 用 扫 描 电 子 显 微 镜 观 察 67+89:(#$;(01(+2.(30 / 405作 用 后 !=,0 和 ?,3 中 ， *+,-+ 启 动 子 活 性 仅 为 F !G 和F $G， *+,-+ B-=,0 和 ?,3 则 无 杀 伤 作 用 ； *+,-+ 启动 子 系 统 诱 导 卵 巢 癌 细 胞 系 的 细 胞 凋 亡 效 能 与 0C5 启 动 子 系 统 相 似 ， 差 异

4、无 显 著 性 （ ! J F ） 。6D14= 2? #A=,0） PL8 *UBPL 9BWQSHLKD :ULI RKWQHW:PNO（ ?,3） X *+,-+ B-HF &万方数据!#$%& #%($)*(*(+ ,-./0 12*%( 3*2*#*3 +( 2(3& $4 #%($&%5 %1 4/67/ 8&%9%$&（ 8:/35.;$%9+)5%!*&2（ ,?） 8&%9%$&（ 8#-ABC.,-./0） ， ) D55 ) !#$%& #%($)*(*(+ /0 +( 2(3&4/67/ 8&%9%$& #%($&%5（ 8:/35.; #)$*%(*# 5*8%9J

5、H%55%D*(+ $4 $&)(1#$*%( D*$4 ,- )(3 /0， K.H, )(3 L, %1 3*11&($ 3% D&)333 )(3 9$45 $4*)M%55 $&)M%5*29（ ?/） )(3 15%D #$%9$& 9$4%3 D& )885*3 $% *(!$*+)$ $4)($*$29%& 11#$ %1 8:/35.;$9P 8:/35.;（ R6?） D) 23 $% S)9*( $4 9%&84%5%+ %1 CBE )1$& $4 )#$*%( %1 8:/35.; D) ;UJ VW )(3 4/67/ 97AB S8&*%( D)8%*$*! *(

6、%!)&*)( #)(#& #55 CBE， D4&) *( AE6, %& F6GH $4 )#$*!*$ D) XJ CW %& XJ #%($&2#$3J ,%98)&3 D*$4 $4 11#$ %1 8:/35.;$9 D) 9%& 11*#*($ %( 4/67/ 8%*$*! %!)&*)( #)(#& #55， I2$ 4)3 (% 11#$ %(4/67/.(+)$*! AE6, )(3 F6GH #55J /4 Y*55*(+ &)$ D) $9 D) ()&5 ) 11*#*($ ) $4 ,? 8&%9%$& $9 *( *(32#*(+#)(#& #55 3)$4（

7、! ZXJ XK） J ,- )(3 /0 +( D& S8&3 *( )55 $4 $4& Y*(3 %1 #55 )1$& 8#-ABC.,-./0 $&)(1#$*%(， D4*5 8%*$*! %(5 *( %!)&*)( #)(#& #55 )1$& 8:/35.; %1 %!)&*)( #)(#&J【 ,- .(/0#】 T /5%9&)； T Q&%9%$& &+*%(（ +($*#） ； T L( $4&)8； T E!)&*)( (%85)9； T/49*3*( Y*()； T A#5%$*3 3)9*()T T 基 因 前 药 激 活 疗 法 （ +($*# 8&%3&2+

8、 )#$*!)$*%($4&)8， LQB/） 是 指 无 细 胞 毒 性 的 药 物 作 用 于 细 胞后 ， 通 过 细 胞 内 成 分 的 激 活 而 变 成 有 毒 性 药 物 ， 其 作为 卵 巢 癌 基 因 治 疗 的 一 种 策 略 备 受 瞩 目 。 胸 苷 激 酶（ $49*3*( Y*()， /0） N 更 昔 洛 韦 （ +)(#*#5%!*&，L,） 和 胞 嘧 啶 脱 氨 酶 （ #$%*( 3)9*()， ,-） NK.氟 胞 嘧 啶 （ K.152%&%#$%*(， K.H,） 是 两 种 最 常 用 的LQB/ V。 其 中 /0 基 因 能 选 择 性 使 抗

9、 病 毒 药 物L, 磷 酸 化 形 成 单 磷 酸 化 产 物 ， 并 在 细 胞 内 磷 酸 激酶 作 用 下 ， 形 成 三 磷 酸 产 物 ， 阻 断 -AB 的 正 常 合 成和 细 胞 增 殖 ； 而 ,- 基 因 可 将 无 毒 性 的 K.H, 脱 氨 基转 换 成 有 毒 性 的 K.氟 尿 嘧 啶 （ K.H） 而 致 细 胞 死 亡 。但 大 量 研 究 发 现 ， 单 一 的 自 杀 基 因 疗 法 存 在 特 异 性差 、 杀 伤 效 率 低 、 毒 副 作 用 强 等 缺 陷 ;， C。 而 ,-./0融 合 的 双 自 杀 基 因 则 可 发 挥 两 种 自 杀

10、基 因 的 杀 伤 作用 ， 最 大 限 度 消 除 肿 瘤 细 胞 对 治 疗 药 物 的 耐 药 性 并减 少 前 药 用 量 ， 降 低 了 前 药 的 毒 性 作 用 ， 有 更 大 的 临床 应 用 价 值 。 为 了 进 一 步 提 高 基 因 治 疗 的 安 全 性 ，将 ,-./0NK.H, O L, 系 统 的 作 用 限 制 在 肿 瘤 细 胞内 而 对 正 常 细 胞 不 发 生 伤 害 ， 因 而 需 要 建 立 一 个 肿瘤 特 异 的 ,-./0 基 因 表 达 系 统 。人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 （ 429)( $5%9&) &!&$&)(#&*8$)， 4

11、/67/） 是 端 粒 酶 重 要 的 组 成 成 分 ， 只在 肿 瘤 细 胞 中 特 异 表 达 ， 并 且 端 粒 酶 活 性 与 4/67/表 达 密 切 相 关 ， 尤 其 在 卵 巢 癌 中 端 粒 酶 活 性 与4/67/ 表 达 之 间 的 相 关 性 超 过 XW U。 4/67/ 活性 调 控 主 要 发 生 在 其 转 录 水 平 。 4/67/ 启 动 子 在端 粒 酶 阳 性 的 细 胞 中 被 激 活 ， 而 在 端 粒 酶 阴 性 的 正常 细 胞 中 受 抑 制 。 我 们 设 想 利 用 4/67/ 的 肿 瘤 特异 性 ， 将 ,-./0 基 因 构 建 于

12、 其 启 动 子 下 游 ， 使 其 治疗 作 用 受 4/67/ 启 动 子 的 调 控 ， 实 现 肿 瘤 特 异 的 靶向 基 因 治 疗 。 本 实 验 构 建 了 4/67/ 启 动 子 调 控 下的 ,-./0 基 因 表 达 系 统 ， 并 检 测 其 对 肿 瘤 细 胞 及 正常 细 胞 的 体 外 杀 伤 作 用 。材 料 与 方 法T T 一 、 材 料 来 源人 浆 液 性 卵 巢 癌 细 胞 系 CBE 及 人 胚 肺 成 纤 维细 胞 株 F6GH 由 山 东 大 学 齐 鲁 医 院 肿 瘤 防 治 中 心 提供 ； 7Q?.V_UX 和 0RH? 培 养 基 购 自

13、 美 国 L:,E 公司 ； 含 4/67/ 启 动 子 的 荧 光 素 酶 报 告 质 粒 8:/35.;/0 及 8#-ABC 质 粒由 山 东 大 学 齐 鲁 医 院 肿 瘤 中 心 刘 春 生 教 授 惠 赠 ； GH.;XXX 脂 质 体 购 自 美 国 (!*$&%+( 公 司 ， L, 和 K.H,购 自 美 国 R*+9) 公 司 ； 4/67/ #-AB 引 物 ， 上 游 ： Kb.,LLBBLBL/L/,/LLBL,BB.Cb， 下 游 ： Kb.LLB/LBBL,LLBL/,/LLB.Cb， 合 成 片 段 VUK I8； /0 基因 引 物 序 列 为 ， 上 游 ：

14、 Kb.L,L,L/B/LL,/,L/B,.Cb， 下 游 ： Kb./,/L,L/L/,BL/BL,/,.Cb， 合 成 片 段 为 VV=X I8； ,- 基 因 引 物 序 列 为 ， 上V=C中 华 妇 产 科 杂 志 ;XXU 年 _ 月 第 C= 卷 第 _ 期 T ,4*( c EI$ L(#%5， c2( ;XXU， %5J C=， A%J _万方数据游 ： !#$%$&%&$%&$%$%$&%&$%#(， 下 游 ： !#$%$ $&%&$%$%&%$&%$%#(， 合 成 片 段 为 )()* +,； 磷 酸 甘 油 醛 脱氢 酶 （ -./0123.415/41 ,567

15、,5381 415/426-19371，$&:; 细 胞 培 养 ： (&?、 5%G% 启 动 子 活 性 的 检 测 ： 用 荧 光 素 酶 分 析法 检 测 ， 操 作 按 照 试 剂 盒 说 明 书 进 行 ， 当 细 胞 达 到J*C汇 合 时 进 行 转 染 。 每 种 细 胞 均 接 种 ( 个 孔 ， 分别 转 染 ,Q%41.#PNR（ 5%G% 启 动 子 ） 、 ,$A(#+37S0（ 不含 启 动 子 的 阴 性 对 照 ） 和 ,$A(#069826.（ 含 MT#=* 增强 子 或 启 动 子 的 阳 性 对 照 ） ( 种 质 粒 。 用 荧 光 素 酶分 析 系

16、 统 在 液 闪 计 数 仪 下 测 量 每 种 细 胞 的 发 光 强度 。 重 复 ( 次 ， 取 其 均 值 。 设 每 种 细 胞 中 ,$A(#069826. 的 荧 光 素 酶 活 性 为 )*C， 同 时 制 作 系 列 酶浓 度 和 发 光 强 度 的 标 准 曲 线 以 确 保 荧 光 素 酶 的 检 测在 线 性 范 围 内 进 行 。( 5%G% FGK& 表 达 的 检 测 ： 按 照 试 剂 盒 说 明书 提 取 总 GK&， 进 行 5%G% 的 G%#:G 反 应 （ 内 对照 为 $&:; 质 粒 的 构 建 ： 将 ,VWA916;-./%L 质 粒 以Q3F

17、 质 粒 的 转 染 ： 按 说 明 书 利 用 AB#P* 脂 质 体向 每 种 细 胞 中 分 别 转 染 ,0;K&(#;#%L、 ,Q%41.#PNR#;#%L 及 ,Q%41.#PNR#%L 质 粒 。J (&?、 K? 和 细 胞 存 活 率 的 检 测 ： 采 用 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝（ H%） 法 ， 分 别 将 (&?、 K?、 细 胞 周 期 的 检 测 ： 不 同 载 体 转 染 的 ( 种 细 胞分 别 按 ) Y)*J个 E F. 的 浓 度 培 养 ， P= 5 后 各 更 换 含$T )* F-E A、 !#B P FF6.E A 的 培 养 液 ， 同 时

18、 以 更换 普 通 培 养 液 作 对 照 ， (NO、 !C ?P培 养 P 4 后 ， 制作 标 本 ， 流 式 细 胞 仪 检 测 细 胞 凋 亡 率 和 细 胞 周 期 。R 细 胞 形 态 的 观 察 ： 将 ,Q%41.#PNR#;#%L 转 染后 的 (&? 细 胞 中 加 入 含 $T )* F-E A、 !#BP FF6.E A的 培 养 液 ， 于 加 药 后 = 4 取 出 盖 玻 片 ， 制 作扫 描 电 子 显 微 镜 标 本 并 观 察 其 形 态 变 化 。三 、 统 计 学 方 法采 用 M&M 统 计 软 件 进 行 检 验 、 方 差 分 析 、 $P检 验

19、 。PR( 中 华 妇 产 科 杂 志 P*= 年 J 月 第 (R 卷 第 J 期 5S9 ?+7818 $/9106.， 91 P*=， T6.U (R， K6U J万方数据结 果一 、 ! 种 细 胞 中 #$%# 启 动 子 的 活 性&#()*+,-. 转 入 !/0 细 胞 后 产 生 与 阴 性 对 照&12!+34567 质 粒 转 染 相 比 显 著 增 高 的 启 动 子 活 性 。其 #$%# 转 录 活 性 （ ,89 :;） 虽 然 只 为 &12!+7?) 1V=)7)( ?*（ +,-.： ! /( 07， A 0( 0） 和B( *（ 1-%2： ! ( )B，

20、 A0( 0） 。 见 图 ?， )。图 ! 不 同 质 粒 转 染 前 后 不 同 浓 度 0 !L$ %） 、 )82.（ / !#$ %） 处 理 ?B D，可 见 7 种 细 胞 均 有 明 显 细 胞 凋 亡 现 象 ， M 期 比 例 也相 应 升 高 ， 7 种 细 胞 间 的 细 胞 凋 亡 率 及 M 期 比 例 比较 ， 差 异 均 无 显 著 性 （ K0( 0)） ； 而 3G9HI#8/&J8.589:$ 0 !L$ %） 作 用 ?B D， 结 果 显 示 ，3G9HI#8/&J89:$ 。七 、 细 胞 凋 亡 小 体 的 形 成76, 细 胞 经 .589:$

21、B0 O/0B P3片 段 ， 称 为 核 心 启 动 子 区 域 ， 该 区 域 序 列 中Q/0B O Q)0之 间 的 )J P3 则 负 责 最 高 的 启 动 子 活性 ， 删 除 该 片 段 可 使 启 动 子 活 性 显 著 下 降 。 本 实验 所 用 的 3G9HI#8/&J 质 粒 即 是 含 Q/&J O ; ) 的 核?J7 中 华 妇 产 科 杂 志 /00? 年 月 第 7J 卷 第 期 N .DRS T ,PUVIV ?+-#A3 ,-. B56-+C ?CD- ED46!#$%&()*-#A3 ,-. B56-+C ?CD- ED46!#$%&()*#A3 ,-

22、.+C ?CD- ED46细 胞 凋 亡 率 (F8* (/F(+ (+F*9 (/F+8 (F*/ +F+) /F(+ /F9* (F8G; 期 比 例 +)F00 +8F/9 +)F)5 +5F)G (*F0+ (*F( (GF)* (/F*8 /GF95告 载 体 转 染 卵 巢 癌 细 胞 ， 结 果 发 现 ， :#DH# 启 动 子活 性 在 卵 巢 癌 细 胞 中 特 异 性 增 高 ， 而 在 正 常 细 胞 中极 低 ， 故 该 启 动 子 是 卵 巢 癌 基 因 治 疗 中 较 为 理 想 的靶 向 启 动 子 。-#A 基 因 的 产 物 同 时 具 有 两 种 酶 的

23、活 性 ， 即具 有 - 和 #A 基 因 的 活 性 。 利 用 两 种 自 杀 基 因 治疗 互 补 作 用 可 以 提 高 应 用 价 值 而 降 低 其 毒 副 作 用 。我 们 的 研 究 结 果 也 发 现 ， !#$%&()*-#A3 56-B ,-. 对 +C 细 胞 的 杀 伤 作 用 显 著 强 于 !#$%&()*#A3 ,-.。 前 者 在 前 药 浓 度 ,-. 为 0I / 123 4、56- 为 0I 5 117&3 4 时 开 始 对 +C 细 胞 发 生 抑 制 作用 ， 到 ,-. 为 /0 123 4、 56- 为 ( 117&3 4 时 细 胞 存活 率

24、 仅 为 (5I 5#A356- B,-. 系 统 前 药 浓 度 的 最 适 范 围 ， ,-. 为 / J/0 1234， 56- 为 / J ( 117&3 4， 此 时 抑 制 细 胞 的 作 用 较强 ， 且 对 正 常 细 胞 的 毒 性 较 小 。:#DH# 和 -K. 启 动 子 系 统 对 +C 细 胞 的 作 用相 似 ； 而 对 正 常 细 胞 的 作 用 则 迥 然 不 同 ， !=?+-#A356- B ,-. 系 统 对 正 常 细 胞 的 作 用 同 +C细 胞 相 似 ， 无 选 择 性 ， !#$%&()*-#A356- B,-. 则 对 正 常 细 胞 几

25、乎 无 抑 制 作 用 ， 说 明 该 体 系 的作 用 具 有 肿 瘤 细 胞 选 择 特 异 性 。尽 管 在 +C 细 胞 中 :#DH# 启 动 子 转 录 活 性 只为 -K. 启 动 子 活 性 的 (0#A356- B ,-. 所 致 +C 细 胞 凋亡 率 显 著 高 于 #A3 ,-. 的 同 时 ， 前 者 ; 期 比 例 也 显著 高 于 后 者 。 这 可 能 与 前 药 作 为 抗 代 谢 药 物 而 将 细胞 周 期 阻 滞 于 ; 期 的 作 用 机 制 有 关 。 为 探 讨 本 实 验中 -#A356- B,-. 作 用 后 +C 细 胞 的 死 亡 形 式

26、，我 们 用 扫 描 电 子 显 微 镜 观 察 了 细 胞 形 态 ， 见 死 亡 的 细胞 中 细 胞 凋 亡 占 据 绝 对 优 势 ， 只 有 极 少 的 坏 死 细 胞 。这 说 明 -#A356- B ,-. 所 致 的 +C 细 胞 死 亡 形式 是 以 细 胞 凋 亡 为 主 。本 研 究 表 明 ， :#DH# 启 动 子 调 控 下 的 -#A356- B ,-. 融 合 双 自 杀 基 因 治 疗 系 统 ， 可 有 效 而 特 异的 杀 伤 卵 巢 癌 细 胞 ， 这 一 肿 瘤 特 异 的 基 因 治 疗 系 统将 实 现 卵 巢 癌 的 靶 向 治 疗 。参 考 文

27、 献/ %LMNOMP ;， 4Q1OP=RNS A， DLPN C， %T M&F 47=M& TQ17QU PUUM$PMTP7O%O:MO=%L T:% MOTPTQ17QU %VV%=T 7V M $7QW&%LQP=P$% 2%O% T:%UM!SLSLT%1 PO M 1QUPO% 2&P71M 17$%&F X ,%O% K%$， (00+， 5： +)+95F( ;:MO$ ?， Y%W%U 6， KMUPMOP 4， %T M&F !:ML% /( =&POP=M& TUPM& 7V2%O% T:%UM!S V7U U%=QUU%OT 2&P7W&MLT71M 1Q&TPV7

28、U1% WS TQ17UTUMOL$Q=TP7O ZPT: T:% :%U!%L LP1!&% T:S1P$PO% NPOML% 2%O% V7&7Z%$WS 2MO=P=&7PUF ,4+(9 DQU7!%MO-MOM$PMO ;TQ$S ,U7Q!F EQ1 ,%O%#:%U， /*， /0： (+(5(+5F+ 6P&MT -， -MUUP7 K， -ML=MOT% ， %T M&F ;QP=P$% 2%O% T:%UM!S1%$PMT%$ WS T:% E%U!%L ;P1!&% PUQL T:S1P$PO% NPOML% 2%O%3,MO=P=&7PU LSLT%1： VPVT%O

29、S%MUL 7V M!&P=MTP7OF -QUU ,%O% #:%U，(00+， +： /+(GF8 UMQOLT%PO ， -7:%OMUMN C， ;:M=:MV -， %T M&F EQ1MO T%&71%UML%U%UL% TUMOL=UP!TML% !U717T%U U%2Q&MTP7O PO O7U1M& MO$ 1M&P2OMOT:Q1MO 7MUPMO %!PT:%&PM& =%&LF -MO=%U H%L， (00/， G/： 55(*55+GF5 AUMLOSN: .?， 7Q2&ML X#， MO %QL%=:%1 .YF ,%O%TP= TMU2%TPO2 7VM$%

30、O7PUM& %=T7ULF K7& #:%U， (000， /（ 5 T /） ： +*/805FG E7UPNMZM ， -MW&% 4， KMRQU ;X， %T M&F 7ZOLTU%M1 DW71%$PMT%$ U%2Q&MTP7O 7V T:% :Q1MO T%&71%UML% U%UL% TUMOL=UP!TML%（ :#DH#） 2%O% TUMOL=UP!TP7O： %P$%O=% V7U MO %O$72%O7QL 1%=:MOPL17V TUMOL=UP!TP7OM& U%!U%LLP7OF K7& P7& -%&， (00(， /+： (595(5*)F（ 收 稿 日 期 ： (00+0*(8）（ 本 文 编 辑 ： 姚 红 萍 ）5*+中 华 妇 产 科 杂 志 (008 年 G 月 第 +* 卷 第 G 期 _ -:PO X CWLT%T ,SO%=7&， XQO% (008， .7&I +*， ?7I G万方数据