人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导的胸苷激酶基因治疗膀胱癌的实验研究.pdf

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1、 论 著 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 启 动 子 调 控 腺 病 毒 介 导的 胸 苷 激 酶 基 因 治 疗 膀 胱 癌 的 实 验 研 究王 亚 轩 ! 蔡 文 清 ! 黎 玮 ! 张 勇 ! 白 志 杰 ! 吴 建 辉! ! 作 者 单 位 ： # 石 家 庄 ， 河 北 医 科 大 学 第 二 医 院 泌 尿 外 科【 摘 要 】 ! 目 的 ! 观 察 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 （ $%&%） 启 动 子 调 控 腺 病 毒 介 导 的 单 纯 疱 疹 病 毒 胸 苷激 酶 基 因 ( 丙 氧 鸟 苷 （ )*+,-.( /0+） 自 杀 基 因 系 统 体 外 对 人 膀

2、 胱 癌 的 选 择 性 杀 伤 效 应 。 ! 方 法 ! 利用 不 同 感 染 复 数 （ 123） 的 重 组 腺 病 毒 携 带 增 强 型 绿 色 荧 光 蛋 白 （ &/45） 基 因 感 染 膀 胱 癌 细 胞 6#78 和人 成 纤 维 细 胞 10,#， 荧 光 显 微 镜 下 观 察 其 感 染 效 率 。 利 用 携 带 不 同 启 动 子 的 重 组 腺 病 毒 9:,$%&%,)*+( -. 以 及 9:,01+,)*+( -. 感 染 6#78 和 10,# 细 胞 ， 加 入 不 同 浓 度 /0+， 1% 法 观 察 受 染细 胞 的 存 活 率 。 ! 结 果

3、 ! 重 组 腺 病 毒 9:,$%&%,&/45 能 特 异 性 转 染 6#78 细 胞 ， 其 转 染 效 率 随 重 组病 毒 的 123 增 加 而 升 高 （ ! ; ! ?1.2.#1 .+ .?:+ A:B7034， A.C.0 D.0?4 F0G0HF*+1 IJIIII， ,F0+【 A#$:%$ JNAUGHMH- M:JHAIGPSK9:,$%&%,&/45 NASB: KJBJN-GIJBT GHOJN- 6#78 NJBBK， WG-$ -$J GHOJN-GAH PM-J MKKANGM-J: WG-$ -$J GHNPJMKGHL123 AO PJNAUGHMH

4、- M:JHAIGPSK（ ! ; ?-# %)4 4 膀 胱 癌 是 泌 尿 系 统 发 病 率 最 高 的 恶 性 肿 瘤 ， 复发 率 可 达 AB CADB ， 治 疗 棘 手 。 近 年 来 单 纯 疱 疹病 毒 胸 苷 激 酶 基 因 E 丙 氧 鸟 苷 （ ?-#E F5） 自 杀基 因 系 统 在 肿 瘤 的 基 因 治 疗 研 究 中 越 来 越 受 到 重视 ， 但 目 前 其 对 细 胞 的 杀 伤 作 用 缺 乏 靶 向 性 。 GHH年 我 们 利 用 人 端 粒 酶 逆 转 录 酶 （ 89:;9） 启 动 子 调 控实 验 观 察 了 ?-# 基 因 在 端 粒

5、酶 阳 性 人 膀 胱 癌 细胞 中 的 特 异 性 表 达 ， 证 实 了 其 对 膀 胱 癌 细 胞 的 特 异杀 伤 作 用 。 现 报 告 如 下 。对 象 与 方 法一 、 材 料培 养 液 ;IJKLMH、 J:J 培 养 基 及 灭 活 胎 牛 血清 （ N0=） 均 购 自 美 国 FK05O 公 司 ， 噻 唑 蓝 （ J99） 购自 美 国 =!%3 公 司 ， F5 购 自 湖 北 科 益 药 业 有 限 公司 。 膀 胱 癌 细 胞 株 GDPQ 由 上 海 东 方 肝 胆 外 科 医 院钱 其 军 博 士 惠 赠 ， 正 常 人 成 纤 维 细 胞 J;5?D 购 自

6、 中科 院 细 胞 库 。 89:;9 启 动 子 调 控 携 带 ?-# 基 因的 重 组 腺 病 毒 （ 6(?89:;9?E -#） 由 河 北 医 科 大 学第 二 医 院 泌 尿 外 科 构 建 （ 上 海 东 方 肝 胆 外 科 医 院 提供 技 术 支 持 ） ， 同 时 构 建 了 89:;9 启 动 子 调 控 带 有报 告 基 因 :FNI 的 重 组 腺 病 毒 （ 6(?89:;9?:FNI）和 由 5J 启 动 子 调 控 携 带 ?-# 基 因 的 重 组 腺 病毒 （ 6(?5J?E -#） 。 按 文 献 方 法 对 重 组 腺 病 毒进 行 扩 增 、 纯 化

7、 和 滴 度 测 定 L， RAHS 保 存 备 用 。二 、 方 法L/ 重 组 腺 病 毒 感 染 效 率 测 定 ： 将 生 长 良 好 的GDPQ、 J;5?D 细 胞 以 L T LH个 E 孔 接 种 于 G 孔 板 ，G 8 细 胞 贴 壁 后 ， 无 血 清 培 养 液 将 细 胞 洗 涤 G 遍 ， 将6(?89:;9?:FNI 以 不 同 感 染 复 数 （ JOK U H、 L、 LH、LHH、 LHHH） 加 入 各 孔 ， DB 5OG孵 箱 PV S 培 养 WH3!， 更 换 完 全 培 养 液 ， 每 种 情 况 均 重 复 P 孔 。 G 8后 在 倒 置 荧

8、 光 显 微 镜 下 观 察 ， 细 胞 内 发 出 绿 色 荧 光说 明 有 :FNI 基 因 表 达 ， 即 已 被 腺 病 毒 转 染 。 计 数LHHH 个 细 胞 ， 计 算 绿 色 荧 光 细 胞 占 细 胞 总 数 的 百 分比 ， 即 腺 病 毒 转 染 率 。G/ 6(?89:;9?E -# 对 膀 胱 癌 细 胞 的 选 择 性抑 制 作 用 ： 将 GDPQ 和 J;5?D 细 胞 分 别 接 种 于 G 孔板 中 ， 每 孔 TLHP个 细 胞 ， 将 G 种 细 胞 分 为 D 组 ， 即6(?89:;9?E -# X F5 组 、 6(?5J?E -# XF5 组

9、、 6(?89:;9?:FNI X F5 组 、 单 纯 6(?89:;9?E -# 组 和 单 纯 F5 组 ， 空 白 对 照 以 I0=替 代 。 各 组 分 别 加 入 上 述 重 组 腺 病 毒 （ JOK U LHH） ，DB 5OG孵 箱 PV S 培 养 WH 3!， 更 换 完 全 培 养 液 ， G8 后 加 入 含 F5 浓 度 为 LHHH !3.$E Y 或 不 含 F5的 完 全 培 养 液 ， 每 种 情 况 均 重 复 P 孔 ， 继 续 培 养 A8。 J99 法 测 定 细 胞 生 长 存 活 率 。P/ 不 同 JOK 的 6(?89:;9?E -# 及

10、不 同 浓 度的 F5 对 GDPQ 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 ： 将 GDPQ 细 胞接 种 于 WM 孔 板 ， 每 孔 TLHP个 ， 然 后 加 入 不 同 JOK的 腺 病 毒 载 体 进 行 转 染 （ JOK U H、 L、 LH、 LHH、 LHHH） ，G 8 后 加 入 F5 浓 度 分 别 为 H、 L、 LH、 LHH、 LHHH!3.$E Y 的 完 全 培 养 液 ， 空 白 对 照 以 I0= 替 代 ， 每 种情 况 均 重 复 P 孔 。 J99 法 测 定 细 胞 生 长 存 活 率 。/ 体 外 旁 观 者 效 应 观 察 ： 将 -# 阳 性

11、和 -# 阴 性 的GDPQ 细 胞 按 H Z LH、 P Z V、 D Z D、 V Z P、 LH Z H 的 比例 混 合 接 种 于 WM 孔 板 中 ， 加 入 F5 使 其 浓 度 为LHHH !3.$E Y， 继 续 培 养 A 8， 对 照 组 为 按 相 同 比 例混 合 后 以 I0= 替 代 F5， 每 种 情 况 重 复 P 孔 。 J99法 测 定 细 胞 存 活 率 。D/ 统 计 学 处 理 ： 组 间 率 的 比 较 采 用 方 差 检 验 ，! H/ HD表 示 差 异 具 有 统 计 学 意 义 。结 4 4 果一 、 重 组 腺 病 毒 对 GDPQ 和

12、 J;5?D 细 胞 的 转 染效 率倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 显 示 ， 加 入 重 组 腺 病 毒6(?89:;9?:FNI， J;5?D 细 胞 未 见 明 显 荧 光 表 达 。而 6(?89:;9?:FNI 对 GDPQ 细 胞 的 转 染 率 随 重 组 腺病 毒 的 JOK 增 高 而 增 加 ， 当 JOK 为 H 时 ， 无 荧 光 表达 ； JOK 为 L 时 ， 仅 少 数 细 胞 有 荧 光 （ A/ PB ） ； JOK为 LH 时 ， PV/ MB 的 GDPQ 细 胞 :FNI 表 达 阳 性 ； JOK为 LHH 时 ， AD/ GB 的 GDPQ

13、 细 胞 :FNI 表 达 阳 性 ； JOK为 LHHH 时 ， 所 有 细 胞 均 出 现 荧 光 。 提 示 G 种 细 胞 的转 染 率 有 明 显 差 异 ， 重 组 腺 病 毒 对 GDPQ 细 胞 转 染 效率 具 有 剂 量 依 赖 性 （ ! H/ HL） 。二 、 6(?89:;9?E -# 对 GDPQ 细 胞 的 选 择 性 抑制 作 用J99 法 结 果 显 示 ， 6(?5J?E -# X F5 组 对GDPQ 和 J;5?D 细 胞 均 有 明 显 的 杀 伤 作 用 ， 但 G 种 细HPG 中 华 泌 尿 外 科 杂 志 GHHD 年 月 第 GM 卷 第 期

14、 4 58! Q *.$， 61*!$ GHHD， .$ GM， ./ 万方数据胞 株 间 无 明 显 差 异 （ ! ! # $ ） ； %&()*+),-./ 01 2 34. 组 5$67 细 胞 存 活 率 明 显 低 于 8+4$细 胞 （ ! 9 # :） ； %&()*+)*3; ）分 组 5$67 细 胞 8+4$ 细 胞%&()*+),-. / 01 2 34. 组 $# ? :# 5!AB# $ :# :!%&48.,-./ 01 2 34. 组 6# ? # $ B# : # ?%&()*+)*3; 。 提 示 34. 在 杀 死 01 阳 性 5$67 细胞 的 同 时

15、 ， 也 可 以 杀 死 与 其 共 培 养 的 01 阴 性 5$67细 胞 ， 同 时 随 着 01 阳 性 5$67 细 胞 比 例 的 增 加 混 合细 胞 的 存 活 数 量 明 显 减 少 （ ! 9# :） 。讨 = = 论自 杀 基 因 疗 法 是 指 将 某 些 病 毒 或 细 菌 的 基 因 转导 入 肿 瘤 细 胞 ， 此 基 因 编 码 的 特 异 性 酶 类 能 将 对 细胞 无 毒 或 毒 性 极 低 的 药 物 前 体 在 肿 瘤 细 胞 内 代 谢 成毒 性 产 物 ， 以 达 到 杀 死 肿 瘤 的 目 的 5。 ,-.01/ 34.系 统 是 肿 瘤 自 杀

16、 基 因 治 疗 中 研 究 最 为 广 泛 的 酶 前 药系 统 之 一 。 ,-.01 基 因 的 表 达 产 物 胸 苷 激 酶 能 将无 毒 的 核 苷 类 似 物 34. 转 化 成 有 毒 性 的 磷 酸 化 物 ，干 扰 细 胞 HI% 的 正 常 合 成 ， 导 致 细 胞 死 亡 6。 当,-.01 基 因 被 导 入 肿 瘤 细 胞 后 ， 加 入 34. 则 可 杀死 转 染 ,-.01 基 因 的 癌 细 胞 ， 从 而 发 挥 肿 瘤 杀 伤 作用 。 我 们 在 体 外 研 究 中 发 现 ， 携 带 01 基 因 的 重 组 腺病 毒 8EF 达 到 :、 34.

17、 浓 度 达 到 : !JKL/ M 时 ，对 膀 胱 癌 细 胞 具 有 明 显 的 细 胞 毒 作 用 ， 细 胞 存 活 率9 : 。 研 究 中 我 们 还 发 现 ， ,-.01/ 34. 系 统 治疗 膀 胱 癌 时 ， 还 可 以 产 生 “ 旁 观 者 效 应 ” B， 即 不 仅可 杀 伤 转 染 了 01 的 5$67 细 胞 （ 01 阳 性 ） ， 与 其 共 培养 未 受 转 染 的 5$67 细 胞 （ 01 阴 性 ） 也 可 被 杀 伤 。 从实 验 中 可 以 看 出 ， 当 01 阳 性 细 胞 占 $ 时 ， 经 34.作 用 后 ， 肿 瘤 细 胞 存

18、活 率 只 有 5?# B 。 旁 观 者 效 应是 ,-.01 基 因 治 疗 的 一 个 重 要 特 征 ， 可 以 明 显 扩 大自 杀 基 因 的 杀 伤 作 用 ， 在 今 后 的 临 床 治 疗 中 具 有 重要 意 义 。= = 基 因 转 移 技 术 除 具 备 合 适 的 治 疗 基 因 外 ， 安 全有 效 的 基 因 载 体 也 是 关 键 因 素 之 一 。 以 往 的 研 究 中多 使 用 逆 转 录 病 毒 作 为 载 体 。 腺 病 毒 是 近 几 年 才 开始 使 用 的 载 体 ， 具 有 能 转 移 至 非 分 裂 相 和 分 裂 相 细胞 ， 感 染 率

19、较 高 ， 可 携 带 较 大 分 子 外 源 基 因 ， 结 构 稳定 ， 病 毒 滴 度 高 ， 安 全 性 高 ； 感 染 时 不 整 合 到 宿 主 染色 体 中 ， 无 致 癌 潜 在 危 险 性 等 优 点 $。 本 研 究 也 应用 腺 病 毒 作 为 载 体 ， 同 时 利 用 *3; ， 8EF 为: 时 感 染 率 可 达 :# 。 *3; ）34.（ !JKL/ M）8EF : : : : : AD# 5 # C AC# : :# 5 A$# ? :# 6 CD# C B# 5: AC# 6 # D A$# B :# D A# 5 5# 6 CA# B B# D $C#

20、? ?# 6: AD# ? # C A:# ? :# A CD# 5 B# 6 $C# A ?# 5 6$# 6 $# : A$# C :# 6 D?# : 5# 6 $A# 6 $# $ 5C# 5 6# D :5# D 5# C: A6# D :# D CC# 5 6# B 6?# C B# 5 ?# : :# B 6# $ # ?:65中 华 泌 尿 外 科 杂 志 5$ 年 B 月 第 5? 卷 第 B 期 = 4(NO 7 PQKL， %RQNL 5$， .KL 5?， IK# B万方数据! ! 在 以 往 的 基 因 治 疗 中 最 常 用 的 是 #$ 启 动 子 ，由 于 #$

21、 启 动 子 无 组 织 和 细 胞 特 异 性 ， 既 可 以 杀 伤肿 瘤 细 胞 ， 也 可 以 杀 伤 正 常 细 胞 ， 安 全 性 差 。 实 验 中我 们 也 发 现 ， %$ 作 用 下 ， #$ 启 动 子 调 控 的 重 组腺 病 毒 &(#$()*$+ ,- 对 ./01 和 #2(/ 细 胞 均具 有 明 显 杀 伤 作 用 ， 二 者 存 活 率 无 明 显 差 异 ； 而34524 启 动 子 调 控 重 组 腺 病 毒 &(34524()*$+ ,-则 对 ./01 细 胞 有 选 择 性 杀 伤 作 用 ， #67 为 899 时 ，其 存 活 率 仅 为 /:

22、 ;: /， ;： .?(.=:0! VDSI )， %FJHAJ 4&， UFF W， A, FK: X3FGA 7 IGA AGMFKF,BIH MKBHBMFK,JBFK IN FAHIRBJDG RAM,IJ MFJJPBHO IG,AIMFKMBH LJIEI,AJ(JBRAH 3AJLAGGBELKAY RBJDG ,3PEBBHA -BHFGA BH KIMFKBQA FH EA,FG,F,BM 3IJEIHA(JANJFM,IJP LJIG,F,A MFHMAJ: )DE %AHA 43AJ， .990， 8： .(.8:! #I3J Z， *3FH-FJF *， WIIH *

23、V， A, FK: %AHA ,3AJFLP IN 3ALF,IMAKKDKFJMFJMBHIEF BH RB,JI FH BH RBRI BH HDA EBMA SP FAHIRBJFK ,JFHGNAJ IN,3A 5GM3AJBM3BF MIKB LDJBHA HDMKAIGBA L3IGL3IJPKFGA OAHA: )ALF,IKI(OP， .999， 08： ;9(;8:/! #F3 ， PJHA 1， KI,A 42: $BJDG(SFGA OAHA AKBRAJP GPG,AEG: KBHX3FJEFMI-BHA,， .99.， 8： =98(=88:;! )BAE 2， DS

24、B, &， 4GBAH 2W: 7ELJIRA OJAAH NKDIJAGMAHMA: TF,DJA，8=/， 00： ;0(;:! VBJM3 )， 2DGM3AH *， JIM-EFHH ， A, FK: 4DEIJ(GLAMBNBM FM,BRF,BIHIN 34524(AJBRA LJIEI,AJG SP ,DEIJ GDLLJAGGBRA 58&(ED,FH,G BH(RIKRAG JAMJDB,EAH, IN L099 + X+ )&4 FH GDLLJAGGBIH IN )&(8FH ANBHAG F MIESBHA ,DEIJ ,FJOA,BHO FH GDLLJAGGBIH

25、GPG,AE: 6HMI(OAHA， .99.， .8： =8(?999:（ 收 稿 日 期 ： .99(89(.）（ 本 文 编 辑 ： 孙 忠 民 ） 国 外 期 刊 文 摘 采 用 尿 囊 壁 外 浆 膜 衬 垫 活 瓣的 可 控 性 回 肠 膀 胱 ： 埃 及#FHGIDJF 大 学 超 过 899例 的 经 验 &SIK(5HABH )， A, FK:1 JIK， .99， 8.： /?! ! 本 文 报 告 采 用 尿 囊 壁 外 浆 膜 衬 垫 活瓣 预 防 尿 液 返 流 和 控 制 尿 囊 出 口 的 可 控性 回 肠 膀 胱 的 疗 效 。 共 有 89= 例 患 者 接受

26、 了 此 手 术 ， 其 中 男 ;? 例 ， 女 . 例 ， 儿童 8 例 。 =0 例 患 者 为 首 次 接 受 尿 流 改道 手 术 ， 其 中 膀 胱 癌 8 例 ， 神 经 原 性 膀胱 89 例 ， 膀 胱 挛 缩 及 括 约 肌 功 能 障 碍89 例 ， 膀 胱 外 翻 . 例 。 8; 例 患 者 是 行 二次 尿 流 改 道 。 手 术 方 法 为 用 U 形 折 叠去 管 状 化 回 肠 重 建 尿 囊 ， 建 立 两 个 浆 膜衬 垫 的 沟 槽 ， 包 埋 两 段 锥 形 缩 窄 的 回 肠 ，一 个 用 来 抗 返 流 ， 另 一 个 作 为 可 控 性 出口 ，

27、 例 患 者 用 阑 尾 代 替 末 段 回 肠 建 立出 口 。 结 果 显 示 ， . 例 患 者 住 院 期 间 死于 肺 栓 塞 ， 8? 例 患 者 （ 8;: /） 个 月 ， 其 中 ? 例 患 者. 3 完 全 控 尿 ， 导 尿 平 均 间 隔 时 间 /3， 平 均 尿 囊 容 量 （ ?9 _ 809） EK。 88 例患 者 （ 88: ? 例 次 远 期 并 发症 ， 包 括 / 例 尿 囊 结 石 ， / 例 皮 肤 造 口 狭窄 ， . 例 导 尿 失 败 ， 8 例 皮 肤 造 口 周 围 疝和 8 例 粘 连 性 肠 梗 阻 。 =: ? 月 第 .; 卷 第 期 ! 3BH 1 JIK， &LJBK .99/， $IK .;， TI: 万方数据