微生物限度检查方法验证方案.docx

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1、微生物限度检查方法验证方案 微生物验证实施小组主要成员： 1概述 药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。所以对感冒灵颗粒微生物限度检查进行方法的验证。 2目的 为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。 3适用范围 本方案适用于感冒灵颗粒微生物方法学的确认与验证。 4验证人员职责 4.1验证小组:组长：质量管理部经理 成员：QC主管、微生物操作人员 4.2职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组织实施该方案； 微生物操作人员具体实施该方案； 质量管理部经理协助和监控该方案

2、的实施。 4.3验证方案批准后，应进行培训。由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培 训。 5验证依据 中国药典2022年版通则“1105”、“1106” 6.感冒灵颗粒微生物限度检验方法验证风险分析 6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。 7.人员培训确认表 8.验证方法 6.1 仪器及设备名称 6.1验证用样品：感冒灵颗粒规格：批号： 感冒灵颗粒规格：批号： 感冒灵颗粒规格：批号： 6.2验证用培养基： 胰酪大豆胨琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号： 营养琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号： 胰酪大豆

3、胨液体培养基生产厂家：批号：配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号： 麦康凯液体培养基生产厂家：批号：配制批号： 麦康凯琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号： 6.3验证用菌种: 金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003） 6.4菌液制备： 6.4.4取经3035培养1824小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105107为不大于10

4、0cfu/ml备用。 6.4.2取经2025培养23天的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至105为不大于100cfu/ml备用。 6.4.3将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20?25培养5?7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液无菌试管内用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每1ml 含孢子数小于100c

5、fu 的孢子悬液。 6.4.4 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24内使用。 6.5供试液制备: 取样品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，为1：10供试液。 7.计数方法的验证： 7.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法） 所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。 7.2试验组 取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。 7.2.1取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单

6、胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.2.2取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.2.3取的试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7

7、.2.4取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.2.5取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.2.6取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于20

8、25倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.2.7取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。 7.3 菌液组 7.3.1取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约1520ml，混匀，凝固，于3035倒置培养3天点计菌落数。各平行制备2个平皿。 7.3.2取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1m

9、l，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各1520ml，混匀，凝固，于2025倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。 7.4 供试品对照组 7.4.1取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注1520 ml温度不超过45胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基3035倒置培养3天点计菌落数， 沙氏葡萄糖琼脂培养基2025倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。 7.4计算公式：稀释剂对照组的回收率= 稀释剂对照组菌落数-供试品对照组菌数100% 菌液组菌落数 试验组菌数回收率= 试验组菌落数-供试品对照组菌数100% 菌液组菌落数 7.5 判定标准：实验

10、组、稀释剂对照组的菌数回收率应在0.52之间。若各试验菌的回收率均符合规定，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。 7.6试验结果 表1 平皿法验证结果1# 批号： 表2 平皿法验证结果2# 批号： 结果说明： 8.控制菌检查方法验证 （1）大肠埃希菌 取1：10供试液10ml两份，分别加入两瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基，其中一瓶加入1ml大肠埃希菌液（不大于100cfu/ml）为试验组；一瓶为供试品；另取一瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基加入10ml 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为阴性对照。 取上述培养物1ml，接种至含100ml 麦康凯液体培养基内培养，4244培养2448小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上3035培养1872小时。 表10 大肠埃希菌常规法验证结果1# 批号： 表11 大肠埃希菌常规法验证结果2# 批号： 表13 大肠埃希菌常规法验证结果3# 批号：