高三一轮复习课件——克隆技术、胚胎工程、生态工程.pptx

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1、专题专题 23 23 克克隆技术、胚胎工程、生态工程隆技术、胚胎工程、生态工程植物细胞的全能性植物细胞的全能性克隆的基础克隆的基础理论基础理论基础: :植物克隆：植物克隆：技术基础：技术基础：动物细胞培养、动物组织培养动物细胞培养、动物组织培养动物的细胞和组织培养的理论基础动物的细胞和组织培养的理论基础: : 动物克隆：动物克隆：技术基础技术基础: :植物组织培养植物组织培养细胞增殖细胞增殖克隆的过程克隆的过程植物克隆植物克隆植物组织培养程序植物组织培养程序琼脂含量？琼脂含量？0.7%1%创伤组织：细胞质丰富、液泡小、细胞核大创伤组织：细胞质丰富、液泡小、细胞核大消毒消毒生活的植株：生活的植株

2、：动物细胞培养程序动物细胞培养程序机械消化和化学消化机械消化和化学消化体外培养的细胞之间相互依存，也像体外培养的细胞之间相互依存，也像体内一样呈现体内一样呈现 特性。特性。当细胞从移植物中生长迁移出来，当细胞从移植物中生长迁移出来，形成形成 并增大后，进行并增大后，进行传代培养传代培养。植物组织培养的培养基植物组织培养的培养基性质：半固体培养基性质：半固体培养基 凝固剂：琼脂凝固剂：琼脂生长调节剂生长调节剂：（：（IAAIAA、CTKCTK）培养基的比较培养基的比较动物细胞培养的培养基动物细胞培养的培养基性质：液体培养基性质：液体培养基 生长调节物质生长调节物质：激素、生长因子激素、生长因子（

3、通常（通常动物血清等代替动物血清等代替）TCM-199 B。即。即TCM-199（Gibco）加超纯水至）加超纯水至1000ml，添加，添加2.92 mmol/L的乳酸钙（的乳酸钙（Sigma），），0.91 mmol/L的丙酮的丙酮酸钠（酸钠（Sigma），），3.05 mmol/L的的葡萄糖葡萄糖75mg/L的青霉素，的青霉素，50mg/L的链霉素的链霉素和和10%的的灭活牛血清灭活牛血清（Gibco）。培养时，在）。培养时，在TCM-199 B中再另加中再另加104IU/L的的PMSG（孕马血清（孕马血清促性腺激素促性腺激素）和）和hCG（人绒毛膜促性腺激（人绒毛膜促性腺激素）。素）。植

4、物克隆的主要几种技术：植物克隆的主要几种技术：1 1、组织培养、组织培养2 2、悬浮细胞培养（胚胎发生途径）、悬浮细胞培养（胚胎发生途径）3 3、原生质体培养、原生质体培养4 4、单倍体培养、单倍体培养 通过调节通过调节营养物质（水、蔗糖、无机盐）和生长调节剂营养物质（水、蔗糖、无机盐）和生长调节剂的适当的适当配比，诱导愈伤组织生芽生根而形成再生新的植株。配比，诱导愈伤组织生芽生根而形成再生新的植株。 通过通过液体悬浮培养液体悬浮培养使愈伤组织分散成使愈伤组织分散成单细胞（胚性细胞）单细胞（胚性细胞），经，经适宜培养基中成分的诱导，可发育成适宜培养基中成分的诱导，可发育成胚状体胚状体，从而形成

5、新株。，从而形成新株。原生质体：去除细胞壁后的植物细胞。原生质体：去除细胞壁后的植物细胞。用适当方法进行原生质体培养，也可以获得新植株。用适当方法进行原生质体培养，也可以获得新植株。用用花药离体培养花药离体培养方法获得单倍体植株。方法获得单倍体植株。单细胞单细胞、 、 、 胚状体。（人工种子）胚状体。（人工种子）5 5、器官培养、器官培养将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培将部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官养，即仍保持组织的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能。培养含叶绿素的器官，需要光照。功能。培养含叶绿

6、素的器官，需要光照。原生质体：原生质体：愈伤愈伤组织组织胚状体胚状体植物细胞工程植物细胞工程 培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNADNA）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过 等到等到将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞转基因细胞或重组细胞进进行培养，获得具有特定性状的行培养，获得具有特定性状的新植株新植株。(3)植物细胞工程技术的应用转基因植株培育。培养特定 ,实现细胞 的工业化生

7、产。单倍体育种。诱发、筛选突变体,如在培养基中加入不同浓度的NaCl或病原体毒蛋白,诱导和筛选抗盐或抗病突变体。细胞融合、显微注射细胞融合、显微注射细胞系细胞系次生代谢产物次生代谢产物问：是不是所有的植物细胞都能充分表现出全能性？问：是不是所有的植物细胞都能充分表现出全能性？ 一是所有的植物细胞都具有全能性，通过植物组织培养程序就可一是所有的植物细胞都具有全能性，通过植物组织培养程序就可以体现出细胞的全能性；以体现出细胞的全能性； 二由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的二由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，它们表达细胞全能性的程度大不相同。差异，它们表

8、达细胞全能性的程度大不相同。长期培养中细胞全能性下降的原因长期培养中细胞全能性下降的原因 染色体畸变染色体畸变 细胞核变异细胞核变异 非整倍体的产生非整倍体的产生 激素平衡被打破激素平衡被打破 对外源生长物质的敏感性发生改变对外源生长物质的敏感性发生改变 其他原因其他原因产生了缺乏成胚性成胚性的细胞系。遗传物质的改变遗传物质的改变生长发生长发育条件育条件的改变的改变问题问题1：植物组织培养培养基的配置过程？：植物组织培养培养基的配置过程？准备工作准备工作吸取母液吸取母液添加添加物添加添加物加热溶解加热溶解调节调节PH培养基分装培养基分装灭菌灭菌问题问题2：固体培养基和液体培养基对细胞生长和繁殖

9、有什么区别？：固体培养基和液体培养基对细胞生长和繁殖有什么区别？营养物质扩散慢，代谢产生有害物质积累。营养物质扩散慢，代谢产生有害物质积累。问题问题3：影响脱分化、再分化的因素有哪些？：影响脱分化、再分化的因素有哪些？自然条件：创伤自然条件：创伤培养基：激素、营养物质配比、光照、温度等培养基：激素、营养物质配比、光照、温度等脱分化后不一定形成愈伤组织，可以直接分化为胚性细胞形成体细胞胚。脱分化后不一定形成愈伤组织，可以直接分化为胚性细胞形成体细胞胚。问题问题4：植物组织培养碳源是什么？：植物组织培养碳源是什么？蔗糖、葡萄糖（灭菌碳化）、果糖、麦芽糖、淀粉蔗糖、葡萄糖（灭菌碳化）、果糖、麦芽糖、

10、淀粉问题问题5：植物组织培养培养基可以加脱落酸、赤霉素之类吗？：植物组织培养培养基可以加脱落酸、赤霉素之类吗？可以可以问题问题6：植物组织培养中渗透压要高一些，为什么：植物组织培养中渗透压要高一些，为什么 ？玻璃化，细胞体积增大速度大于干物质积累，细胞含水过高。玻璃化，细胞体积增大速度大于干物质积累，细胞含水过高。解决办法：增加琼脂浓度、蔗糖浓度。解决办法：增加琼脂浓度、蔗糖浓度。 降低激素浓度、降低降低激素浓度、降低N比例、增加无机盐比例降低细胞生长。增加光照促进比例、增加无机盐比例降低细胞生长。增加光照促进细胞壁木质化，降低空气湿度。细胞壁木质化，降低空气湿度。问题问题7：植物组织培养中影

11、响继代培养的因素有哪些？：植物组织培养中影响继代培养的因素有哪些？内在因素：植物种类、植物基因型、染色体畸变、细胞激素失衡、细胞敏感性改变、内在因素：植物种类、植物基因型、染色体畸变、细胞激素失衡、细胞敏感性改变、继代培养的代数。继代培养的代数。外在因素：季节影响、培养基成分改变、培养条件（温度、外在因素：季节影响、培养基成分改变、培养条件（温度、PH）问题问题8：光照与植物形态建成。：光照与植物形态建成。问题问题9：植物细胞悬浮培养方法？：植物细胞悬浮培养方法？分批培养、半连续培养、连续培养分批培养、半连续培养、连续培养问题问题10：细胞增殖测定方法？细胞周期同步化方法？：细胞增殖测定方法？

12、细胞周期同步化方法？细胞鲜重、干重、细胞数量细胞鲜重、干重、细胞数量分选法、低温处理、饥饿法（限制营养）、抑制剂法分选法、低温处理、饥饿法（限制营养）、抑制剂法问题问题11：保存植物细胞？：保存植物细胞？低温保存、高渗透压保存（蔗糖、甘露醇、山梨醇）、降低氧分压低温保存、高渗透压保存（蔗糖、甘露醇、山梨醇）、降低氧分压 在植物体的发育过程中，由于不同细胞逐渐向不同方向分化，从而形成了在植物体的发育过程中，由于不同细胞逐渐向不同方向分化，从而形成了具有各种特殊构造和机能的细胞、组织和器官，这个过程称为形态建成。具有各种特殊构造和机能的细胞、组织和器官，这个过程称为形态建成。考点1-16-典例精析

13、典例精析1（2016.10）某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答下列问题。回答下列问题。(1)原生质体的分离原生质体的分离:在无菌条件下在无菌条件下,取烟草无菌苗的叶片取烟草无菌苗的叶片,放入含有放入含有0.5 mol/L甘露醇甘露醇(维持较高渗透压维持较高渗透压)的的混合液处理混合液处理,经过离经过离心纯化后获得原生质体。心纯化后获得原生质体。 考点1-17-(2)原生质体的培养原生质体的培养:将原生质体进行培养将原生质体进行培养,重新长出细胞壁重新长出细胞壁,形成胚性细胞。形成胚性细胞。此时此时,应该应该培养基中甘露醇浓度培养基中甘露

14、醇浓度,以利于胚性细胞继续培养形成细以利于胚性细胞继续培养形成细胞团胞团,然后经两条途径形成再生植株。途径一然后经两条途径形成再生植株。途径一:细胞团经球形胚、细胞团经球形胚、-和胚状体和胚状体,最后发育成植株。途径二最后发育成植株。途径二:细胞团增殖为愈伤组织细胞团增殖为愈伤组织,然后在发芽然后在发芽培养基上诱导出芽培养基上诱导出芽,切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是含量相对较高的激素是,胚性细胞的主要特点是胚性细胞的主要特点是(A.液泡小、细胞核小液泡小、细胞核小B.液泡大液泡大,细胞核大细胞核大C.液泡大液泡大

15、,细胞核小细胞核小D.液泡液泡小、细胞核大小、细胞核大)。 (3)为了对烟草的某些性状进行改良为了对烟草的某些性状进行改良,分离的到两种烟草的原生质体后分离的到两种烟草的原生质体后,通通过过方法将它们的遗传物质组合在一起方法将它们的遗传物质组合在一起,经培养获得具有经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的新性状的再生植株。提取再生植株的DNA,采用采用扩增相关扩增相关基因基因,来鉴定遗传物质是否成功重组。来鉴定遗传物质是否成功重组。 PCR方法方法降低降低心形胚心形胚细胞分裂素细胞分裂素D D原生质体融合原生质体融合（2016.4）将被侵染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中

16、培养过程正确的是（ ）A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株（2）取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中，将试管置于_上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是_，从而使叶片保持正常形态。 维持渗透压 B 摇床摇床（2017.11）回答与植物克隆和动物克隆有关的问题:（1）利用植

17、物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的_途径，二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用腋芽带的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在_。（2）利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的_侵染植株，或通过_的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因，另一方面利用异源植株的_ 进行融合产生杂种植株，或利用异源植株在试管内进行_，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。（3）下列属于植物克隆和动物克隆共有培养方法是（） A悬浮培养、器官培养B.贴壁培养、传代培养

18、C.器官培养、愈伤组织培养D原生质体培养、传代培养 A器官发生器官发生分生组织分生组织农杆菌农杆菌显微注射显微注射 原生质体原生质体 受精受精（2018.4）取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_（答 2点即可）。 水稻的基因型、愈伤组织继代的次数水稻的基因型、愈伤组织继代的次数消毒消毒 脱分化脱分化-21-知识强化植物克隆有关的几种技术比较 -23-动物的克隆1.动物细

19、胞、组织培养 从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。原代培养：原代培养：传代培养传代培养 当原代培养的细胞处于当原代培养的细胞处于接触抑制接触抑制后后, , 用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理, ,使细胞从瓶壁上脱离下来使细胞从瓶壁上脱离下来, ,然后加入然后加入新的培养液新的培养液, ,将将细胞分细胞分离稀释离稀释, ,并从原培养瓶内并从原培养瓶内 转接到新的培养瓶转接到新的培养瓶 内内, ,这个过程这个过程称称传代培养传代培养。细胞系、细胞株细胞系、细胞株传代细胞传代细胞克隆培养法（细胞克隆）克隆培养法（细胞克隆） 最基本要求：最基本要求：保证分离出的细胞是

20、一个而不是多个保证分离出的细胞是一个而不是多个 克隆的难易程度：克隆的难易程度：连续细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞的克隆易于原代培养细连续细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞的克隆易于原代培养细胞、有限细胞系；胞、有限细胞系；群体细胞的克隆易于单细胞群体细胞的克隆易于单细胞 提高细胞克隆形成率的措施提高细胞克隆形成率的措施: P30: P30 主要用途：从普通细胞系中主要用途：从普通细胞系中 分离出缺乏特殊基因的突变细胞系分离出缺乏特殊基因的突变细胞系未经克隆的细胞系具有未经克隆的细胞系具有 性。性。异质异质大部分细胞7.2-7.4胚胎成纤维细胞7.47.7 成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚

21、胎时期的间充质细胞分成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤维细胞 可以合成和分泌可以合成和分泌大量胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖，为其它动物细胞培养提供支持。大量胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖，为其它动物细胞培养提供支持。阿米巴（变形虫），是一种肉眼几乎看不见的阿米巴（变形虫），是一种肉眼几乎看不见的单细胞原生物，其直径最大不超过单细胞原生物，其

22、直径最大不超过0.6厘米，厘米，变形虫能在脑浆中伸出借以向各方向运动的伪变形虫能在脑浆中伸出借以向各方向运动的伪足。足。动物细胞融合和应用动物细胞融合和应用2、应用、应用1、细胞融合的方法？、细胞融合的方法？灭活仙台病毒、聚乙二醇、电融合技术灭活仙台病毒、聚乙二醇、电融合技术低压交流电场，击穿质膜脂双层低压交流电场，击穿质膜脂双层导致胞质融通导致胞质融通a.基因定位：人鼠杂交细胞基因定位：人鼠杂交细胞b.单克隆抗体制备：小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞单克隆抗体制备：小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞1号染色体丢失，尿苷单磷酸激酶活性丧失号染色体丢失，尿苷单磷酸激酶活性丧失1.动物免疫动物免疫2.分离分离B淋巴细胞

23、（淋巴细胞（）3.细胞融合细胞融合4.杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选5.单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备单抗的制备过程单抗的制备过程体内表达体内表达体外表达体外表达优点：优点： 可以从特异抗原成分比例极少的可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。抗原混合物中获得单抗。第一次筛选出第一次筛选出杂交瘤细胞杂交瘤细胞第二次筛选出能第二次筛选出能产生特异性抗体产生特异性抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞（有限稀释法、（有限稀释法、多孔培养板）多孔培养板）用途用途:用于治疗疾病用于治疗疾病;作为特异作为特异探针探针,研究相应抗原研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能蛋白的结构、细胞学分布及其功

24、能。 动物的基因组中，动物的基因组中，一类基因是维持生存的，在各种细胞中都一类基因是维持生存的，在各种细胞中都处于活动的状态处于活动的状态。另一类基因随着组织器官和发育阶段不同另一类基因随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。而选择性表达。（分子水平看：不同的调节蛋白调控基因的（分子水平看：不同的调节蛋白调控基因的表达）表达） 分化的分化的细胞内基因的活动很不完全，细胞内基因的活动很不完全，因此很难像受精卵那样因此很难像受精卵那样发挥细胞全能性。发挥细胞全能性。 胚胎细胞克隆胚胎细胞克隆比高度分化的比高度分化的体细胞克隆体细胞克隆要容易得多。要容易得多。 低等动物全能性容易体现（低等动物全能性

25、容易体现（水螅消化细胞不经分裂可以转变水螅消化细胞不经分裂可以转变为上皮细胞、肌肉细胞为上皮细胞、肌肉细胞）动物难以克隆的原因动物难以克隆的原因(1)动物细胞全能性的表现程度受精卵受精卵具有全能性。多能多能细胞只具有分化出多种组织细胞的潜能。单能细胞只能分化为一种细胞。高度分化的细胞不再分化为其他细胞。(2)动物难以克隆的根本原因动物的个体发育过程中,分化使得细胞在形态和功能上高高度特化度特化,这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化,基因表达基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质蛋白质。：化学处理、紫外：化学处理、紫外光灭活染色体、显微镜手术去核光灭活染色体、显微镜手术去核可

26、以可以乳腺细胞传代乳腺细胞传代36代以后，代以后，再进行血清饥饿处理，诱再进行血清饥饿处理，诱导细胞进入导细胞进入G0时期。方时期。方法是法是0.5的胎牛血清培养。的胎牛血清培养。因为因为G1晚期细胞核移植，晚期细胞核移植，出现大概率的染色体异常，出现大概率的染色体异常，G0/G1期核移植后，构建期核移植后，构建的重组胚染色体异常较少。的重组胚染色体异常较少。电脉冲细胞融合技术、显微注射法电脉冲细胞融合技术、显微注射法克隆羊成功的分子细胞生物学机理：克隆羊成功的分子细胞生物学机理：P36P36 重组移核细胞丢失来源于乳腺细胞的调节蛋白（重组移核细胞丢失来源于乳腺细胞的调节蛋白（阻阻止核基因的表

27、达，因此重组细胞最初分裂时，止核基因的表达，因此重组细胞最初分裂时，DNADNA只复制只复制不转录不转录），开始），开始第三次第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白便分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白便全部被卵细胞质中的蛋白因子（全部被卵细胞质中的蛋白因子（促进核基因的表达促进核基因的表达）替换）替换了，因此了，因此核核DNADNA被重新编排被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控胚在代孕母亲子宫中的进一步发育。进而调控胚在代孕母亲子宫中的进一步发育。体细胞克隆成功的意义：体细胞克隆成功的意义：P37P371 1、证明了高度分化的细胞，经过一定的技术处理，也可、证明了高度

28、分化的细胞，经过一定的技术处理，也可以回复到类似受精卵时期的功能。以回复到类似受精卵时期的功能。2 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。应用：应用：P37P37 遗传疾病的治疗、优良品种的培育、物种优化、濒危遗传疾病的治疗、优良品种的培育、物种优化、濒危动物的保存、转基因动物的扩群、丰富物质生活。动物的保存、转基因动物的扩群、丰富物质生活。-36-典例精析1下图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线(图中B、E两点表示经筛选后继续培养),请据图回答下列问题。-37-(1)OB段的培养称为段的培养称为培养培养,AB段可能发生了段可能发生了现现象象

29、,需要用需要用酶处理使组织细胞分散开来酶处理使组织细胞分散开来,分装到多个卡氏分装到多个卡氏瓶中进行瓶中进行培养。培养。 (2) 上述动物细胞培养过程有很多重要的现象上述动物细胞培养过程有很多重要的现象,下列叙述正确的下列叙述正确的是是。 A.E点以后的细胞大多数具有二倍体核型点以后的细胞大多数具有二倍体核型B.若培养过程中某些细胞癌变后能在合适条件下逆转为正常细若培养过程中某些细胞癌变后能在合适条件下逆转为正常细胞胞C.由由B点后筛选出多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆点后筛选出多个祖细胞培养形成的细胞群为一个克隆D.未经克隆化培养的细胞系细胞具有相同的性状未经克隆化培养的细胞系细胞具有相

30、同的性状(3) 动物细胞培养一般放在动物细胞培养一般放在培养箱中培养箱中,提高培养成功率还提高培养成功率还可在培养基中添加一些物质或细胞可在培养基中添加一些物质或细胞,加入滋养细胞目的是加入滋养细胞目的是。 (1)原代接触抑制胰蛋白传代原代接触抑制胰蛋白传代(2)B(3)CO2恒温支持生长恒温支持生长(促进分裂促进分裂,抑制分化抑制分化)-38-典例精析典例精析2(2017浙江台州模拟浙江台州模拟)请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。请回答杂交瘤技术和单克隆抗体制备的有关问题。(1)杂交瘤技术制备单克隆抗体时杂交瘤技术制备单克隆抗体时,利用一定的物质利用一定的物质,如生物诱导剂如生物诱

31、导剂作作介导介导,使经免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合使经免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选出融合的细胞再进行细胞的筛选出融合的细胞再进行细胞的培养培养,获得纯系细胞获得纯系细胞,同时还要进行同时还要进行 检验检验,以保证获得的是所需的特定杂交瘤以保证获得的是所需的特定杂交瘤细胞。细胞。 (2)获得杂交瘤细胞后获得杂交瘤细胞后,在体外培养时需要特别加入的天然成分是在体外培养时需要特别加入的天然成分是。 (3)下列有关杂交瘤细胞体外培养的叙述下列有关杂交瘤细胞体外培养的叙述,正确的是正确的是。 A.用固体培养基培养用固体培养基培养 B.用滋养层细胞支持生长用滋养层细胞支持生长C.能进行传代培

32、养能进行传代培养 D.需要对细胞进行研磨破碎获得产物需要对细胞进行研磨破碎获得产物(4)现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体现在欲利用基因工程技术生产单克隆抗体,科研小组将与抗体形成有关的关键基科研小组将与抗体形成有关的关键基因通过噬菌体导入受体细胞因通过噬菌体导入受体细胞,该技术的核心步骤是该技术的核心步骤是,噬菌体是这些噬菌体是这些关键基因的关键基因的。 (1)灭活的灭活的(仙台仙台)病毒克隆抗体病毒克隆抗体(2)动物血清动物血清(3)C(4)形成重组形成重组DNA分子载体分子载体例题：下列关于细胞全能性的叙述，错误的是例题：下列关于细胞全能性的叙述，错误的是例题：下图为植物细胞融合及组织

33、培养过程示意图。相关说法例题：下图为植物细胞融合及组织培养过程示意图。相关说法错误的是关于植物组织培养的叙述，错误的是错误的是关于植物组织培养的叙述，错误的是例题：下列没有应用植物组织培养技术的是例题：下列没有应用植物组织培养技术的是例题：下列关于植物组织培养的叙述，错误的是例题：下列关于植物组织培养的叙述，错误的是考点2-48-知识强化植物组织培养和动物细胞培养的比较考点2-49-考点2-50-第三章第三章 胚胎工程胚胎工程1、排卵、排卵2、受精、受精卵核卵核精核精核2 细胞期细胞期4 细胞期细胞期8 细胞期细胞期4、桑椹胚、桑椹胚5、囊胚、囊胚内细内细胞团胞团滋养层滋养层6、植入、植入(着

34、床着床)卵巢卵巢3、卵裂、卵裂动物的个体发育的过程动物的个体发育的过程1 1、卵裂：指受精卵、卵裂：指受精卵不断不断进行的细胞分裂。进行的细胞分裂。 （不等同于受精卵的分裂）（不等同于受精卵的分裂）2 2、卵裂过程，细胞只分裂，不生长，因此、卵裂过程，细胞只分裂，不生长，因此细胞体积细胞体积 越来越小，胚胎总体积基本保持不变。越来越小，胚胎总体积基本保持不变。3 3、卵裂是一个耗能过程，能量来自卵黄的分解，因、卵裂是一个耗能过程，能量来自卵黄的分解，因 此所含此所含有机物的量越来越少有机物的量越来越少。2 2、胚胎发育中细胞分化开始于原肠胚期，此前的细、胚胎发育中细胞分化开始于原肠胚期，此前的

35、细 胞都具很高的全能性，胞都具很高的全能性，此后全能性逐渐降低。此后全能性逐渐降低。体外受精体外受精胚胎体外培养胚胎体外培养胚胎移植、胚胎移植、胚胎分割、胚胎分割、胚胎干细胞培养胚胎干细胞培养胚胎工程胚胎工程研究的重要内容：研究的重要内容：（技术手段）（技术手段）研究的对象：研究的对象：高等脊椎动物，特别是哺乳动物高等脊椎动物，特别是哺乳动物体外受精策略：体外受精策略： 3.精子获能精子获能-卵母细胞成熟卵母细胞成熟-受精卵受精卵-胚胎体外培养（早胚胎体外培养（早期囊胚）期囊胚）-胚胎移植胚胎移植-幼体幼体体内受精策略：体内受精策略：1.体内受精体内受精幼体幼体2.超数排卵超数排卵体内受精体内

36、受精取出早期胚胎取出早期胚胎胚胎移胚胎移植植幼体幼体4.胚胎干细胞胚胎干细胞细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞胚胎体外培养胚胎体外培养胚胎胚胎移植移植幼体幼体5.体细胞体细胞细胞核移植细胞核移植重组细胞重组细胞胚胎体外培养胚胎体外培养胚胎移胚胎移植植幼体幼体超数排卵超数排卵早期胚胎早期胚胎胚胎分割胚胎分割（胚胎体外培养）（胚胎体外培养）胚胎移胚胎移植植幼体幼体不需要不需要体内在输卵管完成。能使精子质膜稳定性下降（胆固醇下降）和体内在输卵管完成。能使精子质膜稳定性下降（胆固醇下降）和钙离子内流的因素都能使精子获能。可以使用咖啡因、血清白蛋钙离子内流的因素都能使精子获能。可以使用咖啡因、血清白蛋

37、白、肝素、钙离子载体等。白、肝素、钙离子载体等。输卵管、卵巢（家畜可以在屠宰场）输卵管、卵巢（家畜可以在屠宰场）卵母细胞的成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟。卵母细胞的成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟。促性腺激素可以促进卵泡发育，特别是核成熟，雌激素和孕酮对卵促性腺激素可以促进卵泡发育，特别是核成熟，雌激素和孕酮对卵母细胞的细胞质成熟有促进作用。胎牛血清中含有各种激素。母细胞的细胞质成熟有促进作用。胎牛血清中含有各种激素。体外受精体外受精1 1、概念：、概念： 采用雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使采用雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，使其在其在试管中受精试管中受精。2 2、过程：、过程： （1

38、1）精子的收集和）精子的收集和获能获能； （2 2）卵母细胞卵母细胞的收集（的收集（超数排卵超数排卵）和）和培养培养； （3 3）获能精子和卵细胞的受精；）获能精子和卵细胞的受精； （4 4）胚胎体外培养）胚胎体外培养 （5 5）胚胎移植）胚胎移植3.3.胚胎移植：胚胎移植： 最适宜时期最适宜时期是是8 8细胞以上的胚胎，如细胞以上的胚胎，如早期囊胚早期囊胚。胚胎体外培养胚胎体外培养 概念：概念：将受精卵在人工环境下培养成将受精卵在人工环境下培养成早期胚胎早期胚胎。 培养液：培养液：（不同时期成分不同）（不同时期成分不同） 胚胎培养比组织、细胞培养要难。胚胎培养比组织、细胞培养要难。胚胎移植胚

39、胎移植1.1.概念：概念： 将经济价值较高、遗传性状优秀的母畜，经过将经济价值较高、遗传性状优秀的母畜，经过激素激素( (促性腺激素促性腺激素) )处理，使其处理，使其超数排卵超数排卵后受精，然后受精，然后将发育的早期胚胎分别移植到后将发育的早期胚胎分别移植到同期发情同期发情的的代孕母的子宫内，通过代孕母妊娠产仔的技术。代孕母的子宫内，通过代孕母妊娠产仔的技术。供体：供体： 提供胚胎提供胚胎的个体。的个体。受体：受体： 接受胚胎接受胚胎的个体。的个体。经配种经配种良种雌性动物。良种雌性动物。未配种未配种一般品种的雌性动物。一般品种的雌性动物。选择选择供体母牛供体母牛受体母牛受体母牛同期发情处理

40、同期发情处理超数排卵超数排卵供体公牛供体公牛配种配种取出早期胚胎取出早期胚胎质量检查、培养质量检查、培养胚胎移植胚胎移植妊娠检查妊娠检查分娩（胚胎移植的牛犊）分娩（胚胎移植的牛犊）2、胚胎移植的过程：（以牛为例）、胚胎移植的过程：（以牛为例）未配种未配种胚胎分割胚胎分割1.1.概念概念: :2.2.优势优势: : 指借助显微操作技术（采用指借助显微操作技术（采用机械方法机械方法或或酶解法）酶解法）将早期胚胎切割成将早期胚胎切割成几等份（内细胞团等分）几等份（内细胞团等分），再移植，再移植到代孕母子宫，产生同卵多仔后代的技术。到代孕母子宫，产生同卵多仔后代的技术。后代具有相同的遗传物质。后代具有

41、相同的遗传物质。可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。可成倍增加胚胎数量，可以快速繁殖良种畜。3.3.特点特点: :胚胎干细胞胚胎干细胞1.1.概念：概念：（ESES细胞），是由细胞），是由早期胚胎（囊胚）的内细早期胚胎（囊胚）的内细胞团胞团分离出来的一类细胞。分离出来的一类细胞。2.2.特点特点: : 未分化、二倍体核型、发育全能性、可分化为多种未分化、二倍体核型、发育全能性、可分化为多种细胞、组织细胞、组织胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的培养 培养关键：培养关键： 需要一种能需要一种能促进胚胎干细胞的生长促进胚胎干细胞的生长，但，但抑制抑制其分化其分化的一种培养体系。的一种培养体系。 培养过

42、程：培养过程： 1、 制备制备饲养层饲养层（胚胎成纤维细胞）；（胚胎成纤维细胞）； 2、培养液中培养胚胎到内细胞团突出饲养层；、培养液中培养胚胎到内细胞团突出饲养层； 3、酶消化或机械剥离内细胞团；、酶消化或机械剥离内细胞团； 4、分为单个细胞；、分为单个细胞； 5、加饲养层继续培养。、加饲养层继续培养。胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植 概念：概念： 将胚胎干细胞将胚胎干细胞核移植核移植到去核的卵细胞中，经到去核的卵细胞中，经过过胚激活、胚胎培养、胚胎移植胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完后直接由受体完成克隆动物的技术。成克隆动物的技术。 过程：过程： 细胞核移植；胚胎培养；胚胎移植。细

43、胞核移植；胚胎培养；胚胎移植。胚胎干细胞的主要用途：胚胎干细胞的主要用途： (1)(1)基因敲除，获得移植器官基因敲除，获得移植器官 (2)(2)培育出人造组织器官，用于器官移植培育出人造组织器官，用于器官移植 (3)(3)改良创造动物新品种。改良创造动物新品种。-72-胚胎干细胞培养及应用(1)来源:囊胚内细胞团。(2)培养:一般用胚胎成纤维细胞作饲养层培养胚胎干细胞,这样可以促进干细胞生长的同时抑制干细胞的分化。(3)获取:把胚胎干细胞放到有饲养层的培养液中培养,直到内细胞团突出饲养层外,用酶消化或机械剥离内细胞团,再把它用酶消化成单个细胞,置于新鲜培养液中培养。(4)应用:胚胎干细胞核移

44、植:将胚胎干细胞核移植到去核卵细胞中,经过胚激活胚激活、胚、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。用干细胞克隆器官,为器官移植提供器官。-73-知识强化1.胎移植生殖范畴归属判定2.胚胎移植操作的误区(1)胚胎移植是哺乳动物哺乳动物胚胎工程中获得后代的唯一方法,而蛙、鱼等体外受精的动物不需要胚胎移植。(2)胚胎移植的对象为早期胚胎早期胚胎(如桑椹胚或囊胚如桑椹胚或囊胚),受精卵或原肠胚均不可作为移植对象。(3)良种牛后代的遗传特性是由供体公牛和供体母牛决定供体公牛和供体母牛决定的,受体母牛只是提供了胚胎发育的场所,不影响后代的遗传特性。-74-3.胚胎分割的方法选择及操作流程 -7

45、5-考点2-76-典例精析1(2017浙江衢州、丽水、湖州、舟山四地联考)世界首个细胞核移植“三父母”婴儿已于2016年4月诞生,引起全球广泛关注。医生首先从母亲的卵细胞取出细胞核,并将其注入已去掉细胞核的捐赠者的卵细胞内,重组细胞就拥有了母亲的核DNA以及捐赠者的线粒体DNA,最后再利用精子进行体外受精。请回答下列问题。(1)医生用这一方法同时培育了5个胚胎,因此母亲的卵巢事先需经处理以获得更多的卵细胞;体外受精前,精子需经培养达到状态。 (1)超数排卵超数排卵(促性腺激素也可促性腺激素也可)获能获能 -77-(2)下列关于体外受精及胚胎工程的叙述,错误的是。 A.精子和卵细胞表面有特异性相

46、互识别的蛋白B.28细胞期的卵裂球每一个细胞都具有全能性C.中胚层是由外胚层的细胞增殖分裂形成的D.体外受精使用的培养液和早期胚胎培养液成分相同 (3)受精卵需经早期发育培养,才能完成植入或着床,通常移植的最适宜时是。胚胎发育到一定阶段,会形成滋养层细胞,这部分细胞将发育成。 (4)在英国获得批准的“三父母”技术则不同,是捐献者的卵细胞与父亲的精子经体外受精形成的受精卵去核后,注入父、母亲所形成受精卵的核,以剔除母亲线粒体中有缺陷的基因信息。该过程涉及的生物技术有体外受精、和胚胎移植。 答案答案 (2)D(3)发育到发育到8细胞以上的胚胎细胞以上的胚胎(早期囊胚、早期胚胎、桑椹胚也可早期囊胚、

47、早期胚胎、桑椹胚也可)胚胎胚胎的附属结构的附属结构(胚外结构、胚盘等合理答案也可胚外结构、胚盘等合理答案也可)(4)核移植胚胎体外培养核移植胚胎体外培养(本小题答案顺序可互换本小题答案顺序可互换) 例题：利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。例题：利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 A. A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B. B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAmRNA C.

48、 C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNADNA序列序列 D. D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白 D4040基因治疗重度免疫缺陷病的实例中，涉及的基本技术手段主要有动物细胞培基因治疗重度免疫缺陷病的实例中，涉及的基本技术手段主要有动物细胞培养、转基因技术。养、转基因技术。4141转基因技术育种克服了传统育种的育种时间长、远缘亲本难以杂交的缺陷转基因技术育种克服了传统育种的育种时间长、远缘亲本难以杂交的缺陷4242高产青霉素菌株是基因工程的产物。高产青霉素菌株是基因工程的产物。4343植物克隆的技术基础是植物细胞的全能性。植物克隆的技

49、术基础是植物细胞的全能性。4444已经高度成熟和分化的植物细胞，就失去了恢复到分生状态的能力，不具有已经高度成熟和分化的植物细胞，就失去了恢复到分生状态的能力，不具有遗传上的全能性。遗传上的全能性。4545由于植物细胞全能性更容易体现，植物的组织培养比动物更容易由于植物细胞全能性更容易体现，植物的组织培养比动物更容易4646同种植物不同基因型个体之间细胞全能性的表达程度相同。同种植物不同基因型个体之间细胞全能性的表达程度相同。4747小麦、水稻等作物的一些品种的培养细胞所诱导出的再生植株，在多次继代小麦、水稻等作物的一些品种的培养细胞所诱导出的再生植株，在多次继代培养后，细胞的全能性表达能力是

50、不会改变的培养后，细胞的全能性表达能力是不会改变的4848植物生长调节剂指的就是人工合成的激素类似物。植物生长调节剂指的就是人工合成的激素类似物。4949在植物克隆试验研究中，需要尽量选择细胞全能性表达充分的基因型。在植物克隆试验研究中，需要尽量选择细胞全能性表达充分的基因型。5050在长期的培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因之一是，在长期的培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因之一是，产生了缺少成胚性的细胞系。产生了缺少成胚性的细胞系。5151随着培养代数的增加，植物细胞对外源生长物质的敏感性会发生改变。随着培养代数的增加，植物细胞对外源生长物质的敏感性会发生