2022年操作流程[参 .pdf

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1、前期准备：1 各种试剂的配方和注意事项50聚丙烯酰胺变性胶母液95g Acrylamide 5g Bis- Acrylamide 加 100ml 双蒸水在热水浴（其溶解过程为吸热过程，加热只为加快溶解速度）中溶清后定容至200ml 即可4保存Acrylamide，Bis- Acrylamide 有毒，配制时需小心。Acrylamide，Bis- Acrylamide 溶解吸热，需长时间溶解。10TBE 107.8g Tris 55.0g 硼酸7.44g EDTA(Na2）将上述药品溶清、定容之1000ml 后装入 10TBE 试剂瓶中即可。10TBE 试剂瓶应用稀盐酸清洗，以免有Tris 残留

2、导致 TBE 中的Tris 沉降。5聚丙烯酰胺变性胶105g 尿素25ml 50%聚丙烯酰胺变性胶母液25ml 10TBE 溶清后定容至 250ml 即可每次稀释时注意 50%聚丙烯酰胺变性胶母液从冰箱中取出会有析出的晶体出现，须在溶清后使用。试剂配制好定容后，需要抽滤。4保存。10过硫酸铵将0.1g 过硫酸铵 ( APS )加入到 1ml去离子水中。要每天新制 ( 或冰箱保存 ) 要 4保存每次配 (两个星期的 ) 8ml-分装Blue Dextran Loading Solution 88.25 （V/V） Forrnamide （去离子甲酰胺）11.75 （V/V） 4.1mM EDTA

3、 (pH8.0) 分子量：292.25 M是通用的表示摩尔每升7.5mgml blue Dextran（蓝色葡聚糖）blue Dextran很昂贵要注意节省。注意最小称量。4保存每管装上样缓冲液8ml, 加 blue Dextran 0.06g 【0.1g 蓝色葡聚糖 2000，去离子甲酰胺6ml】现用此配方制备聚丙烯氨凝胶1.将板子从机器上卸下， 在工作台上放平， 把玻璃板从架子上拿出来， 然后用软尺从板子背面顶进将上下两块玻璃板分开。在清洗前先用报纸或者粗名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - -

4、- - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 糙的纸沾掉上次使用过的残胶。 然后用水和无磷洗涤剂清洗玻璃板，在清洗的过程中要先冲掉玻璃板上未沾掉的残胶然后用蘸有洗涤剂的柔软的布擦拭，最后用去离子水彻底清洗。 板子一定要洗干净， 不然会对结果有影响。 让玻璃板在无尘埃环境中自然干燥。 干燥时玻璃板内侧应向里摆放. （有字的一面为不接触胶的外侧. ）2.待玻璃板完全干燥后将下面的玻璃板放在架子上,内侧冲上 ,再放上垫片然后是另一块玻璃板 ,内侧朝下 ,玻璃板下沿和垫片要注意对齐。用架子上的夹子(每边 3 4个)将前后玻璃板固定好。3.用30CC 注射器取 5聚丙烯

5、酰胺凝胶 21ml，并加入新配制的 10% 过硫酸铵125ul 和TEMED13.5ul 温和混匀。用30CC 注射器将混合好的凝胶缓慢注入平放的玻璃板中，注入凝胶的同时应用洗耳球拍打， 帮助胶液缓慢平稳移动，避免产生气泡。在胶液出现V形状的地方应重点拍打 .4.待胶流到玻璃板底部后，在玻璃板间反向插入64孔的鲨鱼齿梳。用 3个夹子固定梳子。 剩余的胶倒入小烧杯， 作为聚合反应的参照物。 聚合反应持续2小时以上，检查聚合反应对照物以确保聚合反应完全。(一)凝胶预电泳1.聚合结束后，从板子上上取下夹子，小心拔下梳子。用枪头除去玻璃板间多余的聚丙烯酰胺凝胶。再用去离子水将玻璃板间的残胶冲出，注意不

6、要留下气泡。将梳子洗净后正向小心地插入玻璃板中，梳齿稍微入胶约0.2 毫米。用纸巾将玻璃板上的扫描区擦净后，将架子放上机器，用机器上的四个卡槽固定好。2.将上缓冲液槽用卡槽固定在玻璃板上， 将1xTBE 缓冲液加入到仪器的上下缓冲液槽中。缓冲液不宜过少上槽需要没过梳子上的数字，下槽加满。3.用充满缓冲液的 30cc 注射器吹去梳子上和梳齿内的气泡，用弯头注射器移去胶底部的气泡。4.连接所有电极，关上仪器门，打开ABI PRISM ? 377 DNA 测序仪收集软件，选择“ Files ”- “New ”- “Gene Scan Run”，就可以开始一个新的测序程序。点击 “ Plate che

7、ck键检查胶的荧光基线。看玻璃板是否干净。若无问题点击Cancel中止程序。如果基线不水平，须将玻板从卡槽中取出并重新擦拭玻板表面，重新检查玻板。5.在“ Plate check 过程中，可以用梳子比对，以避开不干净的加样孔。6.使用GS 36F-2400作为“ PreRun”和“ Run ”的程序。该程序设置的胶温度为51，电流为 40MA，电压为 3KV。点击“PreRun 键开始预电泳 15-20 分钟或预电泳至胶的温度达到 51。打开状态窗口 Window Status 以检测凝胶温度和电流电压大小。一般新胶温度达到51时，电流为 40MA，电压为名师资料总结 - - -精品资料欢迎下

8、载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 2.4-2.8KV, 旧胶电流为 30MA多一些 ,电压为 3KV.7.预电泳期间准备样品 , 但必须等到 Scan窗口的荧光基线跳出才能离开. 如基线迟迟不跳出 , 说明扫描头卡住了 , 需将程序暂停后 , 卸下架子活动一下扫描头. 然后再重新预电泳 . ( 二)制备样品及上样，电泳。1.决定并记录上样顺序。2.ROX+ 上样缓冲液 +样品, 各取1ul, 共3ul 。先配好 ROX 和上样缓冲液的mixture ，

9、分装成每管 2ul ，再加入样品。 94 变性2分钟。然后迅速置于冰水混合物上冷却。变性后尽量立即上样。3.检查上样缓冲液槽内的电泳缓冲液的量是否足够，进行预电泳15-20 分钟后，按“pause”键暂停仪器（这时水会继续循环保持上样过程中凝胶的温度）。用充满缓冲液的 30cc 注射器吹去齿梳内外的气泡。使用上样枪头将1.3 l 变性样本上样。上样时将上样枪头插入胶孔，缓慢将样品打出同时枪头慢慢抬起。这样可以避免样品漏出。4.检查上样缓冲液槽内的液体的量是否足够，关上仪器门。如果过夜电泳，缓冲液应该适量多加。进行第二次电泳，要事先观察电泳缓冲液是否足够。5.可以分开单双道进行加样。 第一次加样

10、后预电泳 3分钟保证两次加样能够分开。6.上样结束后，按 Cancel 键停止预电泳。确证电泳设置正确后，按“Run ”键开始电泳。并将胶图保存在适当的位置。Plate Check Module (平板检测模式 ) Plate Check F Prerun Module (预电泳模式 ) GS 36F-2400 Run Module： ( 电泳模式 ) GS 36F-2400 Collect Time ：( 收集时间 ) 2.5 小时（根据样品长度决定）Well-to-Read distance: (可读距离 ) 36cm Sample Sheet 64 Sample Lines 64 lin

11、es Run Mode XL Scan or 96Line Scan 7.在仪器使用记录本上记录电泳开始和结束时间以及电泳内容仪器状况等。8.通过观察胶图及状态窗控制电泳。通过Window 窗口下调出 Status 窗口和Electrophoresis Histroy窗口。*新胶一般在前几分钟电压会下降，说明电流上升。然后电流下降，最终电压升高直至 3KV 。老胶则较稳定。如果电压一直下降，说明胶有问题，需重新配胶。9.电泳结束后，关闭软件。10. 利用Gene Scan找到并打开胶图，追踪胶道，保证每条道内的峰都在提取线上。11. 点击“ Extract Lines”提取泳道数据，并将数据转

12、移到PC 机上。( 三)数据分析名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 1.使用Gene mapper ID 软件进行大规模数据分析。分析前要对MAC 机上导出的数据进行改名，将原文件名加上后缀“.fsa ”（利用 Doc下rename 命令可提高改名速度）2.在Gene mapper ID下导入要分析的文件。3.对Panel、Analysis 、Size Match进行设置。设置好后点击进行分析。具体设置方法见下文。4

13、.分析好后选中要检查的文件，点击屏幕上方按钮进行具体的峰型检查。在检查过程中要注意一些错位、连带、干扰峰。他们会对结果造成很大名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 影响。5.设置Analysis method，点击下拉菜单。选中定义好的或者新设。新设选择Microsatellite Name 栏输入名字然后选择 peak detector Analysis 决定时间范围段可通过设置去掉前期的引物和探针峰。Sizing

14、决定峰高的范围。Smoothing 决定峰的平滑度，有三个可选项一般选择Heavy Peak Detection 决定各个颜色峰的最低判断值，我们只对“R ”红峰定义。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 6.在这里我们使用常用的预设Panel, 只要在界面下拉框选中我们要用的Panel就可以了。7.Size Standard 内参设定 , 选中要设定的下拉框，选择新设，点选要定义的内参，输入内参大小，最后输入Name 就可以了。我们使用的内参大小为79、105、131、151、201、254。8.分析好后数据的导出，选择要导出的数据后点选File Export Table 然后选取要保存的文件夹即可。9.导出的数据为 .txt文本文件，但可以用 Excel 打开或者分析处理。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -