2022年BDFACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤_corr_ZYH_.docx

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1、名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -BD FACSCalibur 流式细胞仪简易操作步骤一、开机1） 先打开净化沟通稳压电源,其次打开 打开运算机；110V 稳压输出电源,再次打开流式细胞仪,最终2） 向前拉开储液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,先将减压阀（红色箭头所示）方向调在 VENT 位置（箭头方向）,再加入超纯水,保持水位在鞘液桶的3/4 左右,加好后拧紧桶盖并将减压阀方向调在 RUN 位置；二、开启 CellQuest 软件、编辑试验文件1） 在屏幕下方点击CELLQuest （第四个图标）启动软件；桌面会显现一Unti

2、tled试验文件,可点击试验文件的左上角的放大钮（绿色）,将试验文件窗口放大；电子版本 : _corr_ZYH_20220520流式细胞仪 BD FACSCalibur流式细胞仪简易操作步骤- 1 - 细心整理归纳 精选学习资料 第 1 页,共 10 页 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -2） 从工具板中点击散点图图示；在试验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标；显现散点图对话方框（当所要编辑的图窗口被选中时,会在其四角显现四个小黑

3、块）；3） 在显现的散点图对话方框中点击Plot Source ,挑选 Acquisition and Analysis 收取、分析 ,确认 X 和 Y 轴参数预设为FSC-H 1024 、SSC-H 1024 ；4）从屏幕上方 Plots 菜单中挑选 Dot Plot 功能,可复制一个同样大小的散点图,在显现的对话方框内挑选 X 轴： FL1-H 1024 ；假如是双标,Y 轴挑选： FL2-H 1024 依据试验检测样品确定所选通道,本步骤选 FL1/FL2 来说明 ,假如是单标,Y 轴挑选： SSC-H ；点击 OK ,FL1/FL2 的散点图显现；完成后可将重制图移至原图右方；细心整理

4、归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 2 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -说明： 散点图（ Dotplot ）,又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系；在图中,横坐标 X 轴和纵坐标 Y 轴参数分别设为 FSC-H 1024 、SSC-H 1024 ；双荧光标记时,其次图 X 和 Y 轴参数分别设为 FL1-H 1024 、FL2-H 1024 ,X 轴为为荧光 1 强度的相对值,单位是道数, Y 轴就通常表示荧

5、光 2 或光散射强度的相对值；仪器使用者可因试验需求来修改全部图谱中显示之参数；修改动作为轻击图谱上 X 和 Y 轴参数,并依需要挑选之（FSC ：细胞大小, SSC ：细胞折射率,FL1 ：FITC 绿色荧光,FL2 ：PE 橙色荧光, FL3 ：PerCP 红色荧光）；5） 在工具板中挑选四象限工具,在 FL1/FL2 散点图上拖动Quadrant 的中心将它设定在（x,y）（ 10 1,10 1）处,这些象限将指定阴性 /阳性区域；6）从工具板中点击直方图图示,在试验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标；单色荧光只需一个直方图,和其次个散点图一样,横坐标挑选 FL-1 ,

6、纵坐标默认为 Counts ；如是双色荧光,需画 2 个直方图,一个横坐标挑选 FL-1-1024 ,另一个横坐标挑选 FL-2-1024 ；7）在上面直方图中画出 M1 和 M2,其中 M1 代表隐性数目（一般标示是 10 1）, M2 代表阳性数目（除 M1 以外全部的部分）；8）从 Stats 菜单中挑选 Quadrant Stats（象限统计） ,5）步骤中的点图将分为四个象限；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 3 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - -

7、- - - - - - -三、建立仪器和运算机之间通讯从 Acquire 菜单中挑选Connect to Cytometer 快捷键 Win+b ,此时会显现Acquisition Control 对话方框；四、仪器设置文件留意： 试验数据质量,取决于最适化仪器设定文件；仪器设定文件不能在数据收取后再更改,讨论人员必需在第一次就使用正确的仪器设定文件；仪器设定文件（Instrument settings ）,含信号器高压（Detector/ Amps）,阈值（ Threshold ）,荧光补偿（Compensation ）等仪器条件的组合；一般而言,仪器设定的次序为 Detector/Amps

8、 - Threshold - Compensation；1） 检查现有仪器条件,从 Cytometer 菜单中挑选Detectors/Amps；显现 Detectors/Amps 窗口；在Detectors/Amps 窗口确认 FSC 与 SSC （依据试验样品确定,一般细胞挑选 LIN ,细菌挑选 LOG ）,其它 FL1-3 为LOG （对数放大）,将其拖至空白区；2）从 Cytometer菜单中挑选Threshold ,显现 Threshold 窗口在 Threshold 窗口：确认FSC 为设阈参数,初步确认预设阈值 52；将其拖至空白区；3）从 Cytometer 菜单中挑选 Com

9、pensation,确认全部预设数值皆为零；将其拖至空白区；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 4 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -五、 上样品、设置仪器使仪器处于 High RUN ,样品管支撑架左移,上阴性对比管样品,支撑架回位；确认Acquisition Control 窗口中 Setup 前需打叉或打勾 即不储存数据,用于仪器设置 ,点击 Acquire ；1、调剂 FSC/SSC 探测器（电压）观看 FSC/SSC 图的变

10、化； FSC 电压 Voltage 预设为 E00 ,可调剂 Amp Gain 从 1.00 9.99 使主要细胞群得以清晰显示（如细胞较大,将 FSC 电压设置于 E-1 ；较小细胞,将FSC 电压设置于 E01 ）；调剂 SSC 电压使主要细胞群得以清晰出现；调剂 FSC/SSC 图的原就,在于能得到一独立离散的细胞族群,该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象；调整定位后,点击Acquisition Control 窗口中的 Pause ；2、Gating 圈选细胞检品中,常含有大小不同、性质相异的细胞群体；我们常用前方散射（FSC ）与侧方散射（ SSC ）的二维位图,即散射光图谱（S

11、catter Plot ）,来圈选出不同细胞群的范畴,挑选性显示出有意义的细胞群体,如下图圈选白血球之淋巴细胞族群；1） 在工具板中挑选多边形的Region ,在 FSC/SSC 散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）；分析样品时,区域内细胞应会出现成红色,可移动或转变外形来圈选有意义的细心整理归纳 精选学习资料 细胞；假如要删除R1 区域,您可以在工具列中点选Gates Region list,以鼠标点 第 5 页,共 10 页 选 R1,再按 Delete键删除 R1 区域；删除R1 区域后,可用绘图工具板,重画R1 ； - - - - - - - - - - - - - - - - -

12、 - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -2） 选取期望 Gate 的 FL1/FL2 散点图,从Plots 菜单中挑选Format dot plot ；在显现的对话方框内,将 No Gate 改选 G1=R1 ；点击 OK ；3、调剂 FL1 、FL2 的探测器（电压）细心整理归纳 精选学习资料 1）点击 Acquisition Control 窗口中的 Restart ；在 Detector/Amps 窗口中调剂FL1 、FL2 1 处； 第 6 页,共 10 页 的电压,使Negative Control细胞群着落

13、在所选直方图或散点图之100-10 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -2）在 Threshold 窗口,适当地提高 要切掉主要细胞族群；FSC 阈值 52 ,以去除碎片或低阶噪音；唯需留意不3）点击 Acquisition Control 窗口中的 Pause 、Abort ；移去阴性对比管,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光,不要再改动 Detector/Amps、Threshold 等数值；4、调剂荧光补偿说明：最适化的最终一步是调剂光谱重迭；

14、（如是单色荧光试验可跳过此步骤）如是 2 色样本,必要时需调剂 FL2-%FL1 ,FL1-%FL2 （如 3 色样本,必要时需调剂 FL2-%FL1 、FL1-%FL2 、FL3-%FL2 、FL2-%FL3 的补偿）；1） High RUN ,换上单染CD3-FITC 管；点击 Acquisition Control 窗口中的 Acquire ；调剂 FL2-%FL1 使 FITC 阳性细胞在 FL1/FL2 散点图的右下象限；补偿调剂可通过点击 来选择或直接拖动滑标上下移动；调剂完毕,点击 Acquisition Control 窗口中的 Pause ；2） 移去单染 CD3 ,换上单染

15、CD19-PE 管；点击 Acquisition Control 窗口中的 Restart ；调剂 FL1-%FL2 使 PE+ 细胞在FL1/FL2散点图的左上象限；调剂完毕,点击Acquisition Control 窗口中的 Pause ；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 7 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -3.）最终以 CD3-FITC/CD19-PE 双染样本上机,点击Acquisition Control窗口中的 Re

16、start ,确定三群细胞工整垂直；当您已完成 2 色荧光之光谱重迭时,点击 Acquisition Control 窗口中的 Pause 、Abort ；4）移去样本管,换上dH2O 管,让仪器暂且处于Standby 状态；关闭Compensation窗口；您已完成 2 色荧光之最适化；六、收集试验数据1）打算储存细胞总数：预设之储存细胞总数为 10000 ；如需修改,从 Acquire 菜单中挑选 Acquisition & Storage,并在显现的窗口功,确认Collection Criteria从10000 of All ,再点击 OK ；细心整理归纳 精选学习资料 - - - -

17、- - - - - - - - - - - 第 8 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -2） 找个档案匣预备储存数据,本机全部数据都贮存在D 盘 data 盘中,按试验日期编排；从 Acquire 菜单中挑选 Parameter Description,显现 Parameter Description 对话方框；点击 Folder ,并在随后显现之对话方框,挑选Your Folder 或新建活页夹,点击此对话方框的 Select Your Folder （一般用试验日期来命名 Folder

18、）；3） 命名即将储存之文件名：点击 Parameter Description 对话方框的 File ,显现文件名编辑窗口,输入文件名（依据试验来打算）,点击此对话方框的 OK；4） Optional ：如有需要,可挑选或在 P1-P5 后的空格中输入相关参数名；如 P1 ：Size, P2： Granularity, P3 ：CD3 FITC ；输入参数名会存入试验档案中,显示在图谱上；5）计数器 Counters ：从 Acquire 菜单中挑选 进度Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数6）开头收集试验数据； LOW RUN （依据 Counters 来调剂速度,一般保持在

19、 700-800/Second ）,将第一管样品放到检测区,在 Acquisition Control 窗口中,将Setup 改成 Setup ,此时 CellQuest 会自动显示 Your Folder 文件名为资料文件名；点击“Acquire ” 便可启动样品之分析测定与数据储存；当运算机胜利地收取足够数据,会自动储存数据文件文件名 .001 ,并会以“ 嘟” 声告知,CellQuest 会自动升幂附加档名成文件名 .002 ；等待下一指示；7）换上超纯水,清洗管路,直到 Counters 连续显示 0/Second 30s 约为 10-20s ,换上下一管样品,点击“Acquire ”

20、 启动样品之分析测定与数据储存；可连续分析直到全部检品都分析完毕；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 9 页,共 10 页 - - - - - - - - - 名师归纳总结 精品学习资料 - - - - - - - - - - - - - - -七、退出软件并关机1） . 检品分析完毕后,记得从屏幕上方File 指令栏挑选Save As ,储存试验文件,以备日后使用,不需每次重新编辑；2） 检品分析完毕后,用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中,选取Disconnect to Cytometer 以断绝运算机与仪器间之联机；之后如不分

21、析数据,您可退出软件“File ”“Quit ” 遇有选项永久挑选“Dont save” ,进行关机程序；3）以 2 ml 10 漂白水取代样品,将样品架置于左位以外管吸除约 1 ml ,再将样品架置于中位 HI RUN 非常钟；改用 2 ml DI water ；重复上述程序,样品架上留约 1 ml DI water；按 STANDBY 五分钟；4）先关闭运算机,其次关闭流式细胞仪,再次关闭 稳压电源；5） 向前拉开储液箱抽屉,先将减压阀方向调在110V 稳压输出电源,先打开净化沟通VENT 位置（箭头方向）,再取出废液桶,将废液倒进预先装有 84 的烧杯中,灭菌处理,装好废液桶,将减压阀方向调在RUN 位置；细心整理归纳 精选学习资料 - - - - - - - - - - - - - - - 第 10 页,共 10 页 - - - - - - - - -