2022年2022年花生幼叶丛生芽高效诱导的制约因素的研究 .pdf

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1、花生幼叶丛生芽高效诱导的制约因素的研究摘要:以花生品种豫花 14 号 4d 苗龄的幼叶为外植体 ,对花生幼叶高频不定芽诱导进行研究在 MS 培养基的基础上 ,添加了芽诱导常用的细胞分裂素6-BA、生长素NAA 及两种不太常用的脱落酸(ABA) 、噻重氮苯基脲 (TDZ), 结果表明 ,单独使用6-BA,NAA 或 TDZ,不定芽诱导率较低 ;采用较高浓度的6-BA(8mg/L) 、较低浓度的 NAA(1mg/L), 添加低浓度的ABA(1mg/L), 不定芽诱导率可达80%以上。最佳诱导培养基为 MS+6-BA 8mg/L+NAA 1mg/L+ABA 1mg/L +AgNO32mg/L, 从

2、整 体上 观 察 ,最 佳 继 代培 养 基 为 MS+6-BA 5mg/L+NAA 2mg/L+AgNO32mg/L 。同时研究发现 ,花生幼叶近叶柄基部切口处不定芽诱导率较高,是较理想的不定芽诱导部位。关键词:花生;组织培养 ;不定芽诱导 ;植株再生 .The Restrictive Factors for Efficient Induction ofAdventitious Buds from Peanut Leafletin vitro Abstract: The efficiency of adventitious bud induction from leaflet were in

3、vestigated using the 4- day seedlings of peanut variety Yuhua 14.The MS medium was added with commonly-used kinin 6-BA,kinetin NAA,and uncommonly-used ABA and thiadiazole Diazo phenyl urea TDZ.Results showed that the adventitious bud induction rate was low in the MS added with only 6-BA,NAA and TDZ,

4、but reached to 80% in the MS added with high concentrations of 6-BA (8mg/L),low concentrations of NAA (1mg/L) and low concentrations ABA (1mg/L),indicating that the MS medium+8mg/L 6-BA+1mg/L NAA+1mg/L ABA+2mg/L AgNO3had the best result for inducing the adventitious buds.The best medium for subcultu

5、re was MS+5mg/L 6-BA+2mg/ L NAA+2mg/L AgNO3.It was also observed that the underside cut near the petiole presented a higher rate of adventitious buds,so was the ideological explant for adventitious bud induction. Key words: Peanut; Tissue culture; Adventitious buds induction; Regeneration 花生是重要的油料和经

6、济作物, 在世界油脂生产中占有举足轻重的地位。随着我国人民生活水平的提高、种植业结构的调整和对外贸易的扩大, 根据不同的名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 市场需要 , 农业生产上对花生品种的需求也向多元化和专用型发展, 选育不同脂肪酸含量和比例的加工型(高硬脂酸含量 ) 、保健型 ( 高多不饱和脂肪酸 ) 、出口型( 高 O/L 比) 花生新种质是花生新品种选育的重要目标1 。 实践证明 , 利用基因工程技术进行油

7、料作物脂肪酸含量和组分调控是种质创新的有效途径24 。花生组织培养及高效植株再生体系的建立是基因转化及外源基因利用的基础, 但目前花生的组培植株再生体系不够理想, 成为基因转化的限制因素之一5 。为此 , 选用河南省大面积推广的花生品种豫花14 号的幼叶作外植体 , 采用不同激素配比的诱导培养基进行了高效丛生芽诱导和植株再生体系研究, 旨在为进一步研究基因转化和脂肪酸调控奠定基础。1.材料1.1植物材料豫花 14号花生品种 , 亚油酸含量 42%,系河南省农业科学院经济作物研究所培育的高亚油酸品种, 由河南省农业科学院经济作物研究所提供。1.2外植体分别采用萌发 4d 的幼叶为外植体。1.3植

8、物激素N-苯基-N-1,2,3-噻二唑 -5- 脲( 噻重氮苯基脲 ,TDZ);6- 苄基嘌呤(6- BA);a- 萘乙酸 (NAA); 脱落酸 (ABA)以及其他常用化学试剂 , 均为国产分析纯。1.4培养基种子预培养培养基为MS培养基。诱导培养基： Y1:MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.5mg/L+AgNO3 2mg/L Y3:MS+6-BA 8mg/L+NAA 0.5mg/L+AgNO3 2mg/L 继代培养基 : F3:MS+ 6 - BA 5mg/L+ NAA 1mg/L+AgNO32mg/L= Y3两者搭配诱导率最高F4:MS+ 6 - BA 5mg/L+ NAA 2mg/

9、L+AgNO32mg/L= Y1 ABA,TDZ宜过滤灭菌。2试验方法2.1 种子预培养选取颗粒饱满、 较大、表面无裂痕、 没有出胚芽的花生种子 ,用镊子加入无菌三角瓶中, 先用 70% 乙醇浸泡 30s, 再用 0.1%HgCl2溶液消毒 8min,用无菌水冲洗 56次, 然后在无菌水中浸泡23h,待花生种皮舒展之后 , 用镊子在超净工作台上将花生种皮去掉, 再去掉一片子叶 , 将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有 MS培养基的无菌罐头瓶中。 接种时种子不宜插入过深 , 插入太深种子变黄不能正常出芽。置光照培养室中, 在 2526, 光照 14h/d 条件下培养。1 期幼叶外植体， 7.13

10、 号无菌蒸馏水培养2 周的幼叶，叶片已展开，呈鲜绿色7-28 号接种制备方法：叶片一半垂直中分为二，一半横切对比，研究不同外植体切法对诱导率的影响，切口朝下接种于培养基中。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 1.Y1:4 皿*10=40 2.Y3:5 皿*10=50 8-17 号第一次继代：转到继代培养基上使芽点进一步分化, 再培养 3 周后统计诱导率。9-4 号统计诱导率。F3：污染 1 皿，正常诱导 11 块，褐

11、化 6 块。诱导率： 11/40=27.5% F4：诱导愈伤组织 19 块，褐化 3 块，诱导率： 19/40=47.5% 幼叶外植体培养基接种外植体快数( 个) 产生不定芽的外植体的快数（个）诱导率（ % ）1 Y1 20 5 25 Y3 20 8 40 2 Y1 25 15 60 Y3 25 10 40 二期外植体：预培养， 去掉一片子叶， 将带有胚芽的另一半子叶接种于无菌罐头瓶中，接种时不宜插入过深，否则，种子变黄不能正常发芽。7-28 号预培养：培养基： Ms预培养基预培养4 天。选取颗粒饱满、较大、表面无裂痕、没有出名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - -

12、 - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 胚芽的花生种子, 用镊子加入无菌三角瓶中, 先用70% 乙醇浸泡30s, 再用0.1%HgCl2溶液消毒 12min, 用无菌水冲洗 56 次, 然后在无菌水中浸泡23h,待花生种皮舒展之后 , 用镊子在超净工作台上将花生种皮去掉, 再去掉一片子叶 , 将剩下带有胚芽的另一半子叶接种于装有MS培养基的无菌罐头瓶中。接种时种子不宜插入过深 , 插入太深种子变黄不能正常出芽。置光照培养室中, 在 2526,光照 14h/d 条件下培养。共计 13 瓶*

13、3=39 个花生粒花生胚轴伸长，有嫩黄色的小叶长出，生长状况良好，如图所示8-2 号接种于 Y1，Y3 两种培养基中，培养观察。制备预培养4d 的幼叶外植体 :用镊子将花生的子叶掰掉, 之后夹紧胚轴 , 再用无菌刀片将花生幼叶从基部切下,将幼叶横切平均一分为三或从近叶柄部1/3 处一分为二（本实验采用此种切法） ,切时应注意将顶端的芽点去除,4d 苗龄的花生幼叶较小 , 尚未展开 , 操作时一定先用镊子将子叶去掉 , 用镊子夹叶片时一定要轻, 否则会将材料夹伤 , 影响诱导率。将外植体分别接种在诱导培养基上, 置光照培养室2526、光照 14h/d 条件下培养, Y1：10 皿*8=80 块Y

14、3：10 皿*8=80 块两周后 , 分别转到继代培养基上使芽点进一步分化, 再培养 3 周后统计诱导率。8-17 号第一次继代：统计名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 有大量愈伤组织和白色物质产生，如图。Y1：污染 3 皿，Y3：污染 4 皿，灭菌后丢掉。剩下的转接到继代培养基上继续培养。继代培养基：F3:MS+ 6 - BA 5mg/L+ NAA 1mg/L+AgNO32mg/L= Y3两者搭配诱导率最高F4:M

15、S+ 6 - BA 5mg/L+ NAA 2mg/L+AgNO32mg/L= Y1 一一对应转接到F3 F4 上。具体为：F3:转 Y3。计 7 皿*8=56 块F4：转 Y1。计 6 皿*8=48 块9-4 号统计诱导率。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - F3：正常诱导 29 块，褐化 8 块。诱导率： 29/56= 51.8% F4：正常诱导 25 块，褐化 4 块，长芽 1 块。诱导率： 25/48=52.1

16、% 培养物表现：有大量愈伤组织和白色物质产生，因培养箱的问题，缺少光照，故看不到绿色芽点分化，只有黄色的愈伤组织，实验无法进一步进行下去。后来，我们将上述实验材料从新转移的Y1和 Y3培养基上进一步诱导， 但是组织却变褐死亡，故此实验终结。3 结论与讨论实验结果表明： 1、预培养 4 天的小叶做外植体，其诱导了比直接再无菌水中浸泡 12 天的叶片做外植体的诱导率要高，其原因可能是因为叶片太老，或者浸泡时间太长导致组织受损等，详细原因还有待于进一步研究。 2、叶片横切（近叶柄处一分为二）比垂直中分的诱导率要高幼叶近叶柄基部切口不定芽诱导率较高, 是较理想的不定芽诱导部位。 3、Y3和 F4搭配诱

17、导率较高。3，参考资料 1 董文召 , 汤丰收 .我国花生优质育种的研究进展及育种策略探讨 J.中国农学通报 ,2002,18(2):77-79. 2 石东乔 , 周奕华 , 陈正华 . 植物脂肪酸调控基因工程研究J.生命科学 ,2002,14(5):291-295. 3 Liu Q,Singh S P,Brubaker C L,et al.High-stearic and high-oleic cottonseed oils produced by hpRNA-media- ted posttranscriptional gene silencing J .Plant Physi- olog

18、y,2002,129:1732-1743. 4 Kinney A J.Development of genetically engineered soy- bean oils for food applications J.Journal of Food Lip- ids,1996,3:273-292. 5 袁美 , 李双玲 , 李海渤 , 等. 农杆菌介导的花生遗传转化现状与分析 J.花生学报 ,2003,32(增刊 ):285-290. 6 方小平 , 许泽永 , 张宗义 . 花生小叶外植体植株再生及农杆菌介导的基因遗传转化J.中国油料 ,1996,16 (4):52-56. 7 瞿桢 ,

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