2022年2022年酵母双杂交原理 .pdf

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1、酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System) 由 Fields 和 Song 等首先在研究真核基因转录调控中建立。 典型的真核生长转录因子，如 GAL4 、 GCN4、 等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域 (DNA-binding domain) 和转录激活结构域(transcription-activating domain) 。前者可识别 DNA 上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结

2、构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有二类载体 : a 含 DNA -binding domain的载体 ; b 含 DNA-activating domain的载体。 上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd 具有核定位序列(nuclear-localization sequence) ， 而 GAL4-ad 没有。因此，在GAL4-ad 氨基端或羧基端应克隆来自SV40 的 T-抗原的一段序列作为核定

3、位的序列。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 1 易于转化、便于回收扩增质粒。2具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 3酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA 结合结构域 (如 GAL4-bd ， LexA-bd) ；另一个基因融合到转录激活结构域(如 GAL4-ad ，VP16) 。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建

4、导致相邻的报道基因表达(如 lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于： 采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行， 而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子 DNA 结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。酵母双杂交筛选原理双杂交系统的建立得力于对真核生

5、物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80 年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域 (DNA binding domain, 简称为 DB，？ BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DB 虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 如酵母细胞的Gal4 蛋白的 DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构

6、域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质 Snf1 和 Snf2 为模型 , 将前者与 Gal4 的 DB 结构域融合 , 另外一个与Gal4 的 AD 结构域的酸性区域融合。 由 DB 和 AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵” (bait)和“猎物”或靶蛋白 (prey or target protein) 。 如果在 Snf1 和 Snf2 之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和 AD 就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的

7、转名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 录与表达。 这个被激活的、 能显示“诱饵”和 “猎物”相互作用的基因称之为报道基因(reporter gene)。 通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此 Fields 等人采用编码-半乳糖苷酶的LacZ 作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4 蛋白调控的GAL1 序列。这个改造过的LacZ基因被整

8、合到酵母染色体URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和 GAL80 基因 (Gal80 是 Gal4的负调控因子 )被缺失 , 从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1 和 Snf2 之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1 和 Snf2 融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶活性。目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields 等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因、 “诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3 基因。经过改造带有HIS

9、3 报道基因的酵母细胞 , 只有当HIS3 被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。HIS3 报道基因的转录表达是由“诱饵”和“猎物”的相互作用所启动的。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。 这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4 蛋白 )激活。通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。其他还有针对“诱饵”或“猎物”表达载体等所作的改进, 这里不一一详述。在双杂交鉴定过程中要经过两次转化, 这个工作量是相当大的, 特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且 , 酵母

10、细胞的转化效率比细菌要低约4 个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen 等人通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a 接合型和接合型 , 这两种单倍体之间接合(mating)能形成二倍体, 但 a 接合型细胞之间或接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点, 他们将文库质粒转化接合型酵母细胞 , “诱饵”表达载体转化a 接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔(lawn), 再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 原则上只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板

11、上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB 融合蛋白和 AD 融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率。在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要, Vidal 等人发展了所谓的逆双杂交系统(reverse two-hybrid system) 。 这项技术的关键是报道基因URA3 的引入。 URA3 基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸 (5-FOA)转化成对细胞有毒

12、的物质。Vidal 等人通过改造在URA3 基因的启动子内引入Gal4 的结合位点。这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活 URA3 基因的表达才能生长。在含有 5-FOA 的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白, 即与 DB 或 AD 融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3 基因不表达 , 则细胞能在含有5-FOA 的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal 等人筛选到了转录因子E2F1 的突变物 , 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1

13、蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们发现了新的E2F1同 DP1 结合的位点。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - 酵母双杂交系统（ yeast two-hybrid system ）酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。该法由Fields 等人于 1989

14、 年首次建立并得到广泛地应用。酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点的双杂交系统（如Sos 蛋白招募系统、PI3K 介导的靶蛋白识别系统和断裂 -泛素为基础的双杂交系统）以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统 （如以 pol为基础的杂交系统和RTA 系统） 等在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性， 扩大了被研究的蛋白质的范围，提高了系统的灵敏度。酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 、蛋白质 -RNA 相互作用的最常用、最有效的工具之一。一、酵母双杂交系统原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程

15、的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80 年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有 DNA 结合结构域（ DNA binding domain ，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为AD ） ，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA 上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建

16、发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4 蛋白的 DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、 含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点易于转化、便于回收扩增质粒；具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；酵母的内源性蛋

17、白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA- 结合结构域（如GAL4-bd ，LexA-bd ） ；另一个基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad ，VP16） 。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达，从而可分析蛋白间的结合作用。Fields 等人以与调控SUC2 基因有关的两个蛋白质Snf1 和 Snf2 为模型，将前者与Gal4的 DB 结构域融合，另外一个与Gal4 的 AD 结构域的酸性区域融合。由DB 和 AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵（bait）

18、”和“猎物或靶蛋白（prey or target protein ） ” 。如果在 Snf1 和 Snf2 之间存在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白上的DB 和 AD 就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、 能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因（reporter gene） 。通过对报道基因表达产物的检测，反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的两个蛋白质之间是否存在相互作用。在此 Fields 等人采用编码-半乳糖苷酶的LacZ 作为报道基因， 并且在该基因的上游调控区引入受 Gal4 蛋白调控的GAL1 序列。这个改造过的LacZ 基

19、因被整合到酵母染色体URA3位上。而酵母的GAL4 基因和 GAL80 基因（ Gal80 是 Gal4 的负调控因子）被缺失，从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1 和 Snf2 之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1 和 Snf2 融合表达载体的酵母细胞才有-半乳糖苷酶活性，单独转化其中任何一个载体都不能检测出-半乳糖苷酶活性。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 酵母双杂交系统能在体内测定

20、蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子 DNA 结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。二、酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、 瞬间的作用也能够通过报告基

21、因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的 cDNA 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到 AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA 片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较， 研

22、究与已知基因在生物学功能上的联系。另外， 也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender 等人 以 神经末端 蛋白alpha-synuclein 蛋 白 为诱 饵蛋 白 ，利用酵 母双 杂交CLONTECH MA TCHMARKER SYSTEM 3 为操作平台，从成人脑cDNA 文库中发现了与alpha-synuclein 相互作用的新蛋白Synphilin-1 ， 并证明了Synphilin-1 与 alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白

23、相互作用的因素，Michael 等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了 alpha-synuclein 的 1-65 个氨基酸残基和Synphilin-1 的 349-555 个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫 （ELISA ） 、免疫共沉淀 （CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。 而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄

24、烷酮醇还原酶DFR 与其抗体scFv 的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、 H3 与抗原之间作用有强弱的差异。Geert 等利用酵母双杂交技术，将DFR 作为诱饵蛋白， 编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上， 将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻

25、止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如： Dengue 病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA 复制与依赖于RNA 的 RNA 聚合酶（ NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。 研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA 病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页

26、 - - - - - - - - - 4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map ）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST 序列， HUA 等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST 序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。三、酵母双杂交系统方法及其优化在双杂交鉴定过程中要经过两次转化，这个工作量是相当

27、大的，特别是寻找新的作用蛋白质的时候尤其如此。而且， 酵母细胞的转化效率比细菌要低约4 个数量级。 因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈。Bendixen 等人通过酵母接合型的引用，避免了两次转化操作，同时又提高了双杂交的效率。在酵母的有性生殖过程中涉及到两种配合类型：a 接合型和接合型，这两种单倍体之间接合（mating）能形成二倍体，但a 接合型细胞之间或接合型细胞之间不能接合形成二倍体。根据酵母有性生殖的这一特点，他们将文库质粒转化接合型酵母细胞， “诱饵”表达载体转化a 接合型细胞。然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔（lawn ） ，再将两种菌苔复印到同一个三重筛选平板上，原则上只有诱饵和

28、靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长。单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB 融合蛋白和 AD 融合蛋白不相互作用的都被淘汰。长出来的克隆进一步通过-半乳糖苷酶活力进行鉴定。这项改进不仅简化了实验操作，而且也提高了双杂交的筛选效率。Vidal 等人发展了所谓的逆双杂交系统（reverse two-hybrid system ） 。这项技术的关键是报道基因 URA3 的引入。 URA3 基因在这里起到了反选择的作用, 它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸 (5-FOA) 转化成对细胞有毒的物质。Vidal 等人通过改造在URA3 基因的启动子内引入Gal4 的结合位点。

29、这个改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上只有当 “诱饵”和 “猎物”相互作用激活URA3 基因的表达才能生长。在含有 5-FOA的完全培养基上“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白，即与 DB 或 AD 融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3 基因不表达，则细胞能在含有5-FOA 的完全培养基上生长。通过这种方法，Vidal 等人筛选到了转录因子E2F1 的突变物，这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB，但是丧失了同另外一种称为DP1 蛋白的结合能力。结果得到了体外结合实验的验证。通过对这些突变蛋白基因的测序，他们发现了新的E2F1

30、 同 DP1 结合的位点。在某些情况下， 在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。检测pGBT 对照载体的转化效率，放置于SD/ Trp 平板上，转化效率应该在x 0 colonies/mg DNA以上。在杂交中， 预转化的诱饵细胞的数量可能不够，杂交效率不高。 当对诱

31、饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。酵母双杂交系统的原理与优点酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。该法由Fields 等人于 1989 年首次建立并得到广泛地应用。酵母双杂交衍生系如酵母双杂交的二

32、元诱饵系统、逆向双杂交系统、非转录读出特点的双杂交系统（如Sos 蛋白招募系统、PI3K 介导的靶蛋白识别系统和断裂 -泛素为基础的双杂交系统）以及转录激活因子与其相关蛋白之间的相互作用的双杂交系统 （如以 pol为基础的杂交系统和RTA 系统） 等在很大程度上克服了传统酵母双杂交系统的局限性， 扩大了被研究的蛋白质的范围，提高了系统的灵敏度。酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 、蛋白质 -RNA 相互作用的最常用、最有效的工具之一。一、酵母双杂交系统原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80 年

33、代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有 DNA 结合结构域（ DNA binding domain ，简称为DB）和转录激活结构域（activation domain ，简称为 AD ） ，它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA 上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能， 而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基

34、因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的DB 虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4 蛋白的 DB 与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42 融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4 结合位点并激活转录。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、 含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点易于转化、便于回收扩增质粒；具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA- 结合结构域（如GAL4-bd ，LexA-bd ） ；另一个基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad ，VP16） 。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达，从而可分析蛋白间的结合作用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -