2022年基因工程复习重点.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 学习好资料欢迎下载DNA影印转Southern blotting：即 DNA印迹杂交,以碱基互补配对为原就,将移与标记探针进行高特异性杂交的方法；Cosmid：黏粒载体, 含有 噬菌体的 cos 位点和质粒的复制子, 是特地为克隆大 片段设计的载体；cDNA library：利用某种生物的总 mRNA合成 cDNA,再将这些 cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行储存和扩增称 cDNA文库；RACE：通过反转录和 PCR技术进行 cDNA末端快速扩增,得到基因转录本的未知 序列,从而获得 mRNA完整序列的方法；RT-PCR：即逆转录 PCR,

2、先用逆转录酶作用于mRNA,以寡聚 dT为引物合成 cDNA第一链,然后用已知一对引物,扩增嵌合分子的一种方法；MCS：包含多个限制酶切位点的一段短的DNA序列；丧插入失活 ：如把外源 DNA片段插入到载体的挑选标记基因中而使此基因失活,失其原有的表现特性,此方法叫插入失活；PCR：是模拟体内 DNA复制条件,应用 DNA聚合酶反应,特异性扩增某一 DNA片 段的技术；mRNA差异显示技术：依据真核生物 mRNA带有 3polydA 的结构,合成polydT12MN 引物与 mRNA的 3端互补,在反转录酶的作用下合成 cDNAmRNA 杂交分子；然后合成 5随机引物 10bp 和 polyd

3、T12MN 引物, PCR扩增获得 全部 mRNA的 cDNA分子；PCR引物扩增片 巢式 PCR：巢式 PCR使用两对 PCR引物扩增完整的片段；第一对 段和一般 PCR相像；其次对引物称为巢式引物 （由于他们在第一次 PCR扩增片段 的内部）结合在第一次 PCR产物内部,使得其次次 PCR扩增片段短于第一次扩增；实时荧光定量 PCR：在 PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号积存实时监 测整个 PCR进程,最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析；蛋白质印迹法： 又称免疫印迹法, 在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上进展起来的蛋白质检测技术, 检测蛋白样品中是否存在抗原,异性；也可以评判

4、新抗体的特同裂酶：来源不同的但却具有相同的识别序列,限制酶切割 DNA后产生相同末端的一组星号活性 ：是指在某些条件下,一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一 种 DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性；载体 ：携带外源基因进入受体细胞的工具；转化 ：重组质粒 DNA分子导入受体细胞的过程；转染 ：以噬菌体和真核病毒作载体构建成重组体并导入受体细胞的过程；同裂酶：来源不同的但却具有相同的识别序列,限制酶切割 DNA后产生相同末端的一组同尾酶： 来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的黏性末端的一类酶cDNA：以 mRNA为模板反转录出的 DNA；反义 RNA：是指与 mRN

5、A互补的 RNA分子,也包括与其它基因文库 ：指某一生物类型全部基因的集合；RNA互补的 RNA分子；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习好资料 欢迎下载DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？DNA的相对分子质量大小；琼脂糖浓度；的存在；离子强度的影响；PCR扩增大量非特异性片段的缘由DNA的分子构象；电源电压；嵌入染料模板：模板中含有杂蛋白质, 模板中含有 Taq 酶抑制剂, 模板中蛋白质没有消 化除净,特殊是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚；模 板核酸变性不完全；引物：引物质量、引

6、物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR失败或扩增条带不 抱负、简洁弥散的常见缘由；酶失活：需留意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭；Mg2+浓度：浓度过高可降低 PCR扩增的特 异性,浓度过低就影响 PCR扩增产量甚至使 PCR扩增失败而不出扩增条带；物理缘由：如变性温度低,变性时间短,极有可能出 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 而降低 PCR扩增效率；反应体积的转变,循环次数过多等如何提高 PCR扩增的特异性？1 上升退火温度可增加引物与模板结合的特异性；现假阴性 ; 退火温度过低,响引物与模板的结合2. 缩短退火和延长时间, 可削减错误引发及余外的 DNA聚合酶分子

7、参加酶促延长 的机会；3. 降低引物和酶的浓度也可以削减错误引发,特殊是能削减引物二聚体的引发；4. 转变 Mg2+的浓度可进一步提高扩增的特异性；5. 引物设计的特异性；6. 削减循环次数；Southern bloting 的主要步骤 1. 待测 DNA样品的制备、酶切 2. 待测 DNA 样品的电泳分别 3. 凝胶中 DNA的变性：碱变性 4.Southern 转膜 印迹 ：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 5. 固定 6.Southern 杂交 预杂交、杂交、洗膜 7. 杂交结果的检测名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - -

8、 - - - 学习好资料 欢迎下载RACE 原理： 通过反转录和 PCR技术进行 cDNA末端快速扩增,得到基因转录本的未知序列,从而获得 mRNA完整序列的方法经典 5 RACE操作步骤： 以基因特异引物 GSP1作为反转录引物产生 cDNA第一链 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下,在 cDNA 3末端加上 Poly （dC）（或Poly （dA）尾 利用锚定引物（ 5OP-IP-oligo （dG）（或 5OP-IP-oligo（dT ）和基因特异引物 GSP1进行第一轮 PCR扩增 以第一轮 PCR反应的产物为模板,以基因特异引物GSP2和内侧引物 IP 进行其次轮 PCR扩增经典 3RA

9、CE操作步骤： 以 mRNA为模板,用反转录引物合成 3端 cDNA第一链,在 5端引入了 OP和 IP 序列 以基因特异引物 GSP1和外侧引物 OP进行第一轮 PCR扩增 以第一轮 PCR扩增的产物为模板, 以基因特异引物 GSP2和内侧引物 IP 进行其次轮 PCR扩增 PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行序列分析限制性内切酶分类：型限制酶： 能识别专一的核苷酸次序, 并在识别点邻近的一些核苷酸上切割双链,但切割序列没有专一性,是随机的；距离认知位可达数千个碱基之远 , 并不能精确定位切割位点,所以并不常用；型限制酶： 能识别专一的核苷酸次序, 并在该次序内的固定位置上切割双链；所

10、认知的位置多为短的回文序列； 所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列；这种限制性内切酶是 DNA重组技术中最常用的工具酶之一；型限制酶：有专一的识别序列,但不是对称的回文次序；限制性内切酶的星号活性产生星号活性的因素： 甘油浓度过高离子强度不适合阳离子的变化溶液中 pH的变化有机溶剂残留的影响影响限制性内切酶活性的因素：DNA的纯度 DNA甲基化程度 DNA的分子结构限制性核酸内切酶的缓冲液酶切消化反应的时间和温度反应体积和甘 油浓度质粒与质粒载体（1）特点 : 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（2）抱负的质粒载体具备条件： 复制子有一个或多个便于检查的遗传标记在非必需区

11、内的DNA片段内有较多的单一限制性内切酶切位点,便于目的基因的克隆 具备适当的拷贝数具有较高的遗传稳固性蓝白斑挑选原理： 载体上有一段- 半乳糖苷酶基因 （Lac Z）的 片段（氨基端）,其上有外源 DNA的插入位点；片段缺失）；可以被 IPTG诱导表达；功能的 - 半乳糖苷酶；互补而产生的硫代半乳糖苷）的作用下,在生色底物- 半乳糖苷酶基因 （ 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有 lacZ+ 细菌在诱导剂 IPTG（异丙基 - -D-X-Gal（5- 溴-4- 氯-3- 吲哚 - -D- 半乳糖苷）存在时产生蓝色沉淀物, 使菌落显蓝色； 假如外源 DNA插入到质粒的多克隆 位点后,无法实现

12、互补,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落；名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页,共 4 页精选学习资料 - - - - - - - - - 学习好资料欢迎下载DNA分子上重组体分子的挑选方法主要有哪些？并简洁阐述其原理；（1）基于载体遗传标记检测法：在构建基因工程载体系统时,载体通常携带了肯定的挑选性遗传标记基因,转化或转染宿主细胞后可以使后者出现出特殊的表型或遗传学特性,据此可进行转化子或重组子的初步挑选；（2）基于克隆 DNA序列检测法： Southern 印迹杂交：依据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分别的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上, 然后通过与已标记的单链 DNA

13、探针的杂交作用以检测这些被转移的 DNA片段；（3）基于外源基因产物检测法：假如目的基因产物能降解某些药物使菌株出现出抗性标记, 或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应,直接挑选含目的基因的克隆子；就可依据抗性或颜色以 gt11 构建 cDNA文库,包装的噬菌体感染大肠杆菌后形成蓝色和无色的两种 噬菌斑,请说明其缘由；答：现在使用的很多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段,其中有- 半乳糖苷酶基因 （lacZ ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息； 在这个编码区中 插入了一个多克隆位点 （MCS）,它并不破坏读框, 但可使少数几个氨基酸插入到 - 半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能,这种

14、载体适用于可编码- 半乳糖苷酶 C 端部分序列的宿主细胞； 因此,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶学活性的蛋白质；这样,lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补,称为-互补；由 - 互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下,在生色底物 X-Gal 存在时产生蓝色菌落, 因而易于识别； 然而,当外源 DNA插入到质粒的多克隆位点后,几乎不行防止地导致无- 互补才能的氨基端片段,使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落； 这种重组子的挑选, 又称为蓝白斑挑选； 如用蓝白斑挑选就经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培育12-16h 后,有重组质粒的细菌形成白色菌落；设计一个试验：让猪的生长激素基因在大肠杆菌中表达；答：从基因文库中猎取猪的生长基因以提取的基因组为模板,加入引物进行 PCR反应将产物进行胶回收, 回收目的片段将目的片段连入质粒载体将连接产物转化至感受态大肠杆菌中进行阳性鉴定,我复制及表达；检测重组质粒是否胜利进行自名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页