2022年完整word版,临床免疫学检验名词解释重要知识点.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应；抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力,其中疏水作用力最强,它是在水溶液中两个疏水基团相互接触,由于对水分子的排斥而趋向集合的力；亲和性（ affinity ）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD ）之间的结合强度,取决于两者空间结构的互补程度；亲合力（ avidity ）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与如干相应抗原表位之间的结合强度,它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效 AD 数目有关；抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段

2、性；带现象（ zone phenomenon）：一种抗原 -抗体反应的现象；在凝集反应或沉淀反应中,由于抗体过剩或抗原过剩,抗原与抗体结合但不能形成大的复合物,从而不显现肉眼可见的反应现象；抗体过量称为前带,抗原过量称为后带；免疫原（ immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原；免疫佐剂（ immuno adjustvant）：简称佐剂,是指某些预先或与抗原同时注入体内,可增强机体对该抗原的免疫应答或转变免疫应答类型的物质；半抗原（ hapten）：又称不完全抗原,是指仅具有与抗体结合的才能抗原性 ,而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质；当半抗原与蛋白

3、质载体结合后即可成为完全抗原；载体（ carrier）：结合后能赐予半抗原以免疫原性的物质；载体效应： 初次免疫与再次免疫时,只有使半抗原结合在同一载体上,才能使机体产生对半 抗原的免疫应答,该现象称为 ；单克隆抗体（ McAB ）：将单个 B 细胞分别出来,加以增殖形成一个克隆群落,该 B 细胞克 隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体,即 ；多克隆抗体（ PcAb）：自然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位,以该抗原物质刺激机体免疫系统,体内多个 白,即 B 细胞克隆被激活,产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋基因工程抗体（ GEAb ）：是利用 DNA 重组及蛋白工程技术,从

4、基因水平对编码抗体的基因 进行改造和装配,经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体；杂交瘤技术【原理】以聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂,使免疫后能产生抗体的小鼠脾细胞与能在体外 长期繁衍的小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞,通过次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT ）挑选性培育基的作用,只让融合胜利的杂交瘤细胞生长,经反复的免疫学检测挑选和单个细胞培育（克隆化）,最终获得机能产生所需单克隆抗体又能长期体外繁衍的杂交瘤细胞系； 将这种细胞扩大培育,接种于小鼠腹腔, 可从小鼠腹水中得到高效价的单克隆抗体；（一）小鼠骨髓瘤细胞 抱负骨髓瘤细胞的条件：细胞株稳固, 易于传代培育； 细胞株本身不产生免疫

5、球蛋白或 细胞因子；该细胞是 HGPRT 或 TK 的缺陷株；能与 B 细胞融合成稳固的杂交瘤细胞；融合率高；目前最常用的是 NS-1 和 SP2/O 细胞株（二）免疫脾细胞名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 多采纳与骨髓瘤细胞同源的纯系BALB/c 小鼠； 免疫途径多为腹腔内或皮内多点注射法；如抗原微量, 可用脾脏内直接注射法进行免疫；细胞性抗原不需加佐剂,可溶性抗原需加完全弗氏佐剂；（三）细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节；一般用分子量1000D、1500D、4000D PEG 作细胞融合剂,浓度 3050 %之

6、间, 基本方法是将骨髓瘤细胞与脾细胞按 1:2 1:10 比例混合,加入 PEG,诱导两种细胞融合,时间掌握在 2min 以内, 再加入培育液缓慢稀释 PEG 融合液, 直至失去融合作用,融合细胞形成具有两个或多个核的异核体,最终产生杂交细胞；（四）杂交瘤细胞的挑选性培育肿瘤细胞合成DNA 有两条途径： 一条为生物合成途径,可被叶酸拮抗物 （氨基蝶呤） 阻断；另一条为替代途径,叶酸代谢受阻时,细胞通过HGPRT 和 TK ,利用核苷酸前体物合成核苷酸,进而合成 DNA ；HAT 培育液含三种成分：次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（ T）,经 HAT 培育液挑选后,只有具备两亲本 细

7、胞双重特性的杂交瘤细胞能长期生存并产生抗体,成为制造单克隆抗体的细胞源；细胞类型正常培育细TK 缺陷细HGPRT缺陷细杂交瘤细正常培育基胞胞胞胞 + + + + HAT 培育 + - - + 基凝集反应（ agglutination reaction）：是指细菌和红细胞或红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后,在适当电解质存在下,显现肉眼可见的凝集现象；直接 ：在适当电解质参与下,细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合后显现肉眼可见的凝集现象,称为 ；间接 ：可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人 O 型红细

8、胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面,然后与相应抗体（抗原）作用,在相宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象,称为 ；其敏锐度高于直接凝集反应和沉淀反应；正向间接凝集反应：用可溶性抗原致敏载体以检测标本中的待检抗体；反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的待检抗原；间接凝集抑制反应：用抗原致敏的载体颗粒及相应的抗体作为诊断试剂,检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原；间接血凝试验： 是以红细胞为载体的间接凝集试验,即用已知的抗原 （或抗体） 致敏红细胞,与标本中相应的抗体（或抗原）特异结合,显现红细胞凝集现象；胶乳凝集抑制试验（LAT ）：将抗原 （或抗体） 致敏胶乳颗粒, 直接与待检标本

9、中的抗体（或抗原）发生凝集反应； （常用的载体颗粒为聚苯乙烯胶乳）直接 coombs 试验：将抗人球蛋白试剂直接加到表面结合抗体的受检红细胞中,即可见细胞凝集；用于检测吸附于红细胞表面的不完全抗体；（如 HDN 、AIHA ）间接 coombs 试验：将受检血清和具有相应抗原性的红细胞相结合,再加入抗人球蛋白抗体名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 即可显现可见的红细胞凝集；用于检测血清中游离的不完全抗体；沉淀反应 （precipitation reaction ）：是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而

10、显现可见的沉淀现象；免疫浊度测定： 是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点,将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应,对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术；钩状效应（ high dose hook effect）：免疫浊度测定,抗原过量导致形成的免疫复合物（IC ）分子小,发生再解离,浊度下降,光散射削减；单向免疫扩散试验：是先将肯定量的抗体混于琼脂凝胶中,使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向四周自由扩散,在肯定区域内形成可见的沉淀环；环的直径或面积的大小与抗原含量正相关；常用于 IgG/A/M 、补体 C3/

11、C4 等血浆蛋白的测定；双向免疫扩散试验：是将抗原核抗体加在同一琼脂板的对应孔中,各自向对方扩散,在浓度比例恰当处形成沉淀线；沉淀线靠近抗原孔,说明抗体浓度较大；靠近抗体孔就说明抗原浓度大；形成的沉淀线弯向分子量大的一方；（待测物为两种抗原）两条沉淀线相互吻合相连, 两抗原中存在相同表位；两条沉淀线交叉, 说明两抗原完全不同；两条沉淀线相切,提示两抗原之间有部分相同；对流免疫电泳（ CIEP ）：实质上是双扩和电泳的结合；在pH8.6 的碱性缓冲液琼脂中进行电泳,分子量小、等电点低、带有较多负电荷的Ag 泳向阳极,而Ab 球蛋白等电点偏高（约为 6-7）,在 pH8.6 时带负电荷较少,加上分

12、子量较大,泳动慢,受电渗（指电场中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退,这样抗原抗体作相对运动,在较短时间内即可相遇,在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线；（抗原加在 -级,抗体加在 +级）抗原浓度越高,沉淀线越接近抗体孔,甚至超过抗体孔；本法简便快速,灵敏度是双扩的816 倍,可检出蛋白质浓度达 g/ml,常用于 Ag/Ab 的性质 /效价 /纯度测定；火箭免疫电泳（RIE ）：实质上是单扩和电泳的结合；是将抗体混合于琼脂中,电泳时,抗体不移动,抗原由负极向正极移动,并随抗原浓度的下降,抗原泳动的基底区也逐步变窄,抗原抗体免疫复合物形成的沉淀西安也越来越窄,形成一个火箭状的不溶性复

13、合物沉淀峰；抗体浓度肯定时,沉淀峰的高度与抗原量呈正相关；其灵敏度可达 蛋白定量；ng/ml,常用于 IgA/G 等免疫电泳（ IEP）：将待测标本（蛋白质抗原）置于琼脂凝胶中电泳,样品中各蛋白成分因所 带电荷、 分子量及构型不同,被分成肉眼不行见的如干区带；然后沿与电泳方向开一平行的 抗体槽并加入抗血清,置室温或 37 度使两者扩散；18-24h 后,各区带蛋白与相应的 Ab 在 相应的位置上形成弧形沉淀线；Ag 越多,沉淀线越靠近 Ab 槽,其沉淀线越粗,可做微小 的蛋白质组分分析,仅为定性试验；免疫固定电泳 （IFE）：实质是区带电泳和沉淀反应相结合；先将血清蛋白质置于琼脂凝胶中名师归纳

14、总结 进行区带电泳分别,再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面的泳道上,经第 3 页,共 12 页过孵育,固定剂和抗血清在凝胶内渗透、扩散,抗原抗体直接发生沉淀反应,洗脱游离的抗- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 体,形成的抗原抗体复合物就保留在凝胶中；经氨基黑, 参考泳道和抗原抗体沉淀区被着色,依据电泳移动距离分别单克隆组分,可对各类Ig 及其轻链进行分型；最常用于M 蛋白的鉴定；放射性核素：具有放射性的核素,在自然条件下可发生自发性的转化变为另一种（放射性）核素,并同时释放射线；这一转变过程称为放射性衰变；放射化学纯度： 指在标记物中结合

15、在抗原 百分比；（或抗体） 上的放射活性占该标记物总放射活性的比放射活性：是指单位质量标记物中所含的放射性活度,或每分子抗原 （或抗体） 平均所结合的放射性原子数目；放射免疫分析（RIA ）：是利用放射性核素标记抗原与非标记抗原（待测 /标准抗原）同时和限量特异性抗体进行竞争性结合反应,通过测定放射性核素标记抗原与抗体复合物的放射性活度,经相应的数学函数关系推算待测抗原的含量；免疫放射分析（IRMA ）：是利用放射性标记的抗体来测定样品中抗原的方法,所用的标记抗体是过量的,抗原全部是非标记的；待测抗原与过量标记抗体结合反应形成标记抗体-抗原复合物及游离的标记抗体,测定的是标记抗体-抗原复合物的

16、量 . 荧光免疫技术： 是将抗原抗体反应与荧光技术相结合而建立的一种免疫荧光技术,具有高度特异性、敏锐性和直观性；荧光抗体技术（FAT）：以荧光素标记抗体对抗原进行定位染色,并借助荧光显微镜观看标本片上荧光染色的形状,从而判定是否存在待测抗原,这种技术就是 ；荧光抗体染色方法：直接法（简便快速特异性强,但敏锐性不如间接法,一种荧光抗体只能检测一种抗原） 、间接法（敏锐性比直接法高 510 倍,一种荧光二抗可检测多种抗原 /抗体,但简洁产生非特异性荧光）、双标记法（用于检测同一标本中的两种抗原）荧光： 荧光物质吸取激发光的能量后,使原先处于基态的电子跃迁到激发态,当其回复至基态时,激发态的电子以

17、发射光的形式释放出能量,这种发射光称为 ；发射光谱：是指固定激发光波长,在不同波长下所记录到的样品发射荧光的谱图激发光谱：是指固定检测发射光（荧光）波长,用不同波长的激发光照耀样品得到的荧光的谱图；荧光效率： 是指荧光分子将吸取的光能转变成荧光的百分率,正比；与发射荧光光量子的数值成荧光效率发射荧光的光量分子数（荧光强度）吸取光的光量子数（激发光强度）荧光猝灭：荧光分子的辐射才能在受到激发光较长时间的照耀后会减弱的现象；只有那些能产生明显荧光的有机化合物才能作为荧光色素；stokes 位移：即激发光谱和发射光谱的波长差；镧系元素 射光谱不重叠,可削减干扰；stokes 位移大（ 273nm）,

18、激发 /发名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 酶免疫技术： 是将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术；是将酶与抗原或抗体结合成酶标记结合物（酶标抗原 /抗体）,酶标结合物既保留了抗原 /抗体的免疫学活性, 同时也保留了酶对底物的催化活性；在酶标记抗体 （抗原） 与抗原 （抗体）的特异性反应完成后,加入酶作用的相应底物,通过酶催化底物产生显色反应,对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定；常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP ）、 -半乳糖苷酶（-Gal ）常用的底物

19、： HRP 有邻苯二胺（ OPD）、四甲基联苯胺（TMB ）；ALP 为对 -硝基苯磷酸酯（p-NPP）； -Gal 为 4-甲基伞形酮 - -D 半乳糖苷（ 4MUG ）常用的标记方法：交联法（戊二醛）和直接法（改良过碘酸钠法）固相载体的挑选：塑料制品（聚苯乙烯、聚氯乙烯）、微粒、膜载体包被（ coating）：将抗体或抗原结合在固相载体上的过程；封闭（ blocking ）：用 1%5% 的牛血清蛋白或 位点,排除非特异性吸附的干扰；酶联免疫吸附试验（ELISA ）5%20% 小牛血清排除固相载体表面未结合的【基本原理】 把抗原或抗体结合到某种固相载体表面并保持其免疫活性（即形成固相抗原或

20、抗体）；将抗原或抗体与酶连接成酶标记抗原或抗体（既保留免疫活性又保留酶的活性）；在测定时, 把受检标本 （测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开,最终结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有肯定的比例,加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,依据颜色反应的深浅进行定性或定量分析；（一） ELISA 检测抗原的方法主要有：1、双抗体夹心法：适用于至少两个抗原打算簇（AD ）的 Ag ；先将特异性抗体与固相载体结合,形成固相抗体, 加入待测标本并温

21、育,使标本中的抗原与固相抗体充分反应,形成固相抗体抗原复合物,洗涤去除其他游离成分；然后加入酶标记抗体并温育,使固相抗体抗原复合物与酶标记抗体结合,形成固相抗体 -待测抗原 -酶标记抗体 复合物,为“ 双抗体夹心”；洗涤去除游离酶标记抗体；加入底物,固相载体结合的酶可催化底物成为有色产物,依据产物的显色程度进行抗原的定性或定量检测；临床上常用于乙肝表面抗原HBsAg 、甲胎蛋白 AFP、人绒毛膜促性腺激素HCG 等项目的检测；2、双位点一步法：该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的抗原打算簇,分别制备两种单克隆抗体,在包被时使用一种单抗,酶标记时使用另一种单抗；测定时将含待测抗原标本和酶

22、标记抗体同时加入反应体系,两种抗体分别与不同的抗原打算簇结合,只进行一次温育, 在洗涤后即可加底物进行显色反应；担当待测抗原浓度过高时,可显现钩状效应,甚至显现假阴性结果,必要时可将标本适当稀释后重新测定；）3、竞争法：适用于小分子 Ag 或半抗原（只有一个 AD ）；先用特异性抗体包被固相载体,然后同时加入待测抗原和酶标记的抗原,待测样本中的抗原与酶标记抗原 竞争性的与固相载体上的特异性抗体结合,温育一段时间后洗涤,加入底物显色；（二） ELISA 检测抗体的方法主要有：名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1、间接

23、法：检测 Ab 最常用的方法；常用酶标记羊抗人 IgG；2、双抗原夹心法：灵敏度和特异性高于间接法,原理类似双抗体夹心法,操作步骤也基本相同,也可采纳一步法, 但一般不会显现钩状效应；临床上乙型肝炎表面抗体 HBsAb 的测定常用此法；3、竞争法：当相应抗原材料中含有难以去除的杂质,不易得到足够的纯化抗原或抗原性质不稳固时,可采纳此方法；主要用于测定HBcAb 和 HBeAb ；原理见下：（1）HBcAb 的竞争法：先将核心抗原包被在固相载体上形成固相抗原,然后加入待测标本和酶标记的特异性核心抗体,此时待测标本中的 HBcAb 与酶标记 HBcAb 竞争性地与固相载体上的核心抗原结合,温育后洗

24、涤, 加入底物显色, 显色的强弱与待测标本中的 HBcAb的含量负相关；（2）HBeAb 的竞争法：先将HBeAb 包被在固相载体上形成固相抗体,同时加入待测标本和中和抗原HBeAg ,此时待测标本中的HBeAb 和固相抗体竞争性地结合中和抗原HBeAg ,温育后洗涤,加入酶标记的HBeAb ,酶标记抗体与结合于固相抗体上的特异性抗原结合,温育后洗涤,加入底物显色,显色强弱与待测标本中 HBeAb 的含量呈负相关；4、捕捉法：又称反向间接法,主要用于血清中特定 染诊断中 IgM 型抗体检测；Ig 类别的测定,最常用于病原体急性感原理：第一将针对 IgM 的其次抗体包被于固相载体形成固相抗体,加

25、入待测标本后,标本中全部的 IgM （特异 /非特异）即可被固相抗体捕捉；其次步加入特异性抗原,其与固相载体上捕捉的 IgM 特异性抗体结合,再加入针对特异性抗原的酶标记抗体,形成 固相抗人链 IgM- 抗原 -酶标记抗体 复合物,最终加入底物显色,即可对待测标本中抗原特异性 IgM进行定性或定量测定；此法临床上常用于病原体急性感染的试验室诊断,如急性甲肝时可检测 HAV-IgM 抗体,急性乙型肝炎时可检测抗 HBc-IgM 抗体；发光免疫分析 （CLIA ）：是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术；兼有高灵敏性和高特异性；发光：分子 /原子中的电

26、子吸取能量后,由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级）,然后再返回到基态,并施放光子的过程；化学发光：相伴化学反应过程所产生的光的发射现象；发光效率： 又称化学发光反应量子产率,是指发光剂在反应中的发光分子数与参与反应的分子数之比,取决于生成激发态产物分子的化学激发效率和激发态分子的发射效率；化学发光免疫技术可分为均相反应（不需分别）和非均相反应（需要分别）非均相分别方式有：固相分别、过滤分别、珠式分别、顺磁性颗粒分别；【化学发光剂】直接化学发光剂：鲁米诺和吖啶酯（常用）间接化学发光剂：鲁米诺及其衍生物、AMPPD 、酞菁 /二甲基噻吩衍生物/Eu 螯合物【标记技术】常用标记方法：碳二亚胺缩

27、合法、过碘酸钠氧化法、重氮盐偶联法影响标记的因素： 发光剂的挑选、 被标记蛋白质的性质、标记方法的挑选、原料比、 标记率、温度、纯化与储存；名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 化学发光酶免疫分析（CLEIA ）【原理】：是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP ）或碱性磷酸酶（ALP ）来标记抗体（或抗原）,与待测标本中相应的抗原（或抗体）发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原 -酶标记抗体 复合物,经洗涤后加入底物（发光剂）,酶催化和分解底物发光； 由光量子阅读系统接收,光电倍增管将光信号转变为

28、电信号并加以放大,再把它们传送至运算机数据处理系统,运算出测定物的浓度；【特点】：属酶免疫测定范畴,测定过程与ELISA 类似,仅最终一步酶反应的底物改为发光剂、测定的仪器改为光信号检测仪；酶标记抗原或抗体结合稳固；酶催化鲁米诺、AMPPD 等发光剂发出的光稳固,连续时间长,便于记录和测定；电化学发光免疫分析（ECLIA ）【原理】是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原）,以三丙胺（ TPA ）为电子供体,在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应（它包括电化学和化学发光两个过程）；在反应体系内待测标本与相应的抗体发生免疫反应,形成磁性微粒包被抗体-待测抗原 -三联吡啶钌标记抗体 复合物,复

29、合物进入流淌室,同时注入 TPA 缓冲液；当磁性微粒流经电极表面时, 被安装在点击下面的电磁铁吸引住,而未结合的标记抗体和标本缓冲液被冲走；与此同时电极加压,启动电化学发光反应,使三联吡啶钌和TPA 在电极表面进行电子转移,产生电化学发光； 光信号由安装在流淌室上方的光信号检测器检测,光的强度与待测抗原的浓 度成正比；【特点】：三联吡啶钌在电场中因不断得到三丙胺供应的电子,可周而复始的发光,连续 时间长,信号强度高,简洁测定、掌握；三联吡啶钌直接标记抗原或抗体,结合稳固,不 影响标记物的理化特性；试剂灵敏度高,稳固性好；生物素（ B）又称维生素H ,分子式为C10H16O3N2S ,等电点（

30、pI）为 3.5；生物素结构中,I 环为咪唑酮环, ,是与亲合素结合的主要部位；II 环为噻吩环,含有一个戊酸侧链,末端羧基是标记抗体或其他分子的唯独结构；抗体分子经生物素化后,其结合抗原的活性不受影响；多种酶经生物素化后,其催化才能保持不变或稍有降低；生物素 -亲合素系统【特点】：高特异性、高敏锐性、稳固强、有用性强【应用】：在标记免疫技术中可应用于标记信号放大环节,也可用于固相包被（或分别）环 节 一、应用于固相载体的包被环节 链霉亲合素（亲合素）为弱酸性蛋白,可以吸附在固相载体（聚苯乙烯微孔板或纳米微球）名师归纳总结 表面, 形成链霉亲合素包被固相载体；利用生物素标记抗原（或抗体）,使待

31、包被的抗原 （抗第 7 页,共 12 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 体）通过生物素与固相材料表面的链霉亲合素结合,实现间接包被；此种包被模式不但可增加抗原（或抗体）包被数量,也可削减空间位阻效应,提高抗原（或抗体）的利用效率；此外,如固相材料不与生物素化抗原（或抗体）结合,待生物素化抗原（或抗体）与待检抗体（或抗原）反应后,再加入链霉亲合素预包被磁性纳米微球,含有生物素的免疫复合物可结合在固相载体表面,达到同样的分别成效；二、应用于检测系统的信号放大生物素 -亲合素系统用于检测信号放大,可提高标记免疫分析的敏锐性；基本方式有 生物素-亲合素 -生

32、物素 模式（ BAB ）和 生物素 -亲合素 模式（ BA ）或标记亲合素模式；如将生物素标记在第一抗体上称为直接法,如生物素标记在其次抗体上称为间接法；生物素 -亲合素 -生物素模式的特点是生物素标记分子（如生物素标记抗体 /酶蛋白）,以游离亲合素为桥,连接 抗原 -抗体 和信号检测系统；由于一个亲合素分子能同时结合 4 个生物素,且一个生物素大分子可标记多个生物素而产生级联放大效应,提升检测敏锐性；实际应用中的 ABC 法：预先按肯定比例将亲合素与生物素标记示踪物质（如生物素标记ALP ）混合,形成可溶性的 亲合素 -生物素化酶标 复合物,同时确保预留肯定位点与生物素化的抗体（或抗原）结合

33、；此种方法能削减操作步骤,又能实现标准化操作（有商品化的试剂）；将 ABC 法应用于双抗体夹心ELISA 中,形成 ABC-ELISA ,为常用方法；固相膜免疫分析技术：是以微孔膜作为固相载体,利用液体可以流过微孔膜也可以通过毛细管作用在膜上向前移行的特性,以酶标记或各种有色微粒子（如彩色胶乳、 胶体金或胶体硒等）标记抗体或抗原作为标记物,通过抗原抗体反应进行抗原或抗体检测的快速检验方法；胶体金免疫技术： 是以胶体金作为示踪标记物或显色剂,疫测定技术；应用于抗原抗体反应的一种标记免胶体金： 也称金溶胶, 是金盐被仍原为金原子后形成的金颗粒悬液；胶体金颗粒由一个基础 金核（原子金 Au ）及包围

34、在外的双离子层构成（内层为负离子层 AuCl2- ,外层是带正电荷 的 H+ ）；由于静电作用, 金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳固的胶体状态,形成带负电 的疏水胶溶液,故称胶体金；免疫金： 是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物；大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程；（一）斑点金免疫渗滤试验（DIGFA ）其制备过程实质上是抗体蛋白等【原理】 是在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中,依次滴加标本、 免疫金及洗涤液, 因微孔滤膜贴置于吸水材料上,快速结合并起到浓缩作用,达到快速检测目的（一般 红色斑点；故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体 5min 左右完成）阳性反应

35、在膜上出现名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 本法简化了操作步骤,达到简便的目的,已成为“ 床旁检测（【方法类型】 ：POCT）” 的主要方法之一；双抗体夹心法： 将抗体包被在硝酸纤维素膜中心,滴加待检标本, 如标本中有待测抗原就在渗滤过程中与膜上抗体结合,然后滴加胶体金标记抗体,加洗涤液洗涤后, 阳性者即在膜 中心呈红色斑点（胶体金集合）；间接法：将抗原包被在硝酸纤维素膜上,依次滴加待测标本、洗涤液和胶体金标记抗人IgG 抗体,再加洗涤液洗涤,阳性者即在膜中心呈红色斑点（胶体金集合）；本法因受非目的 IgG 的干扰

36、,易产生假阳性,临床上较少使用；（二）斑点金免疫层析试验（DICA ）【原理】是将胶体金标记和蛋白质层析 技术相结合的,以硝酸纤维素膜为载体的快速固相 膜免疫分析技术； 在 DICA 中,滴加在膜一端的标本溶液受载体末的毛细管作用向另一端移 动,如同层析一般, 在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而 被固相化,无关物就越过该区域而被分别,然后通过胶体金的呈色条带来判读试验结果；【方法类型】 ：双抗体夹心法、竞争法、间接法（三）临床应用及评判1、特点：操作简便、快捷以及操作人员不需技术培训,无需特别仪器设备,试剂稳固、便 于储存等特点；2、灵敏度问题：灵敏度不及酶标法和酶

37、发光免疫测定法,临床应用中应引起高度重视；3、临床应用：临床只能作为定性/半定量试验,目前主要应用于正常体液中不存在的物质（如传染病抗原和抗体以及毒品类药物）和正常含量极低而在特别情形下反常上升的物质（如人绒毛膜促性腺激素 HCG ）；斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA ）【原理】与常规的 ELISA 相同,不同之处在于斑点-ELISA 所用载体为对蛋白质具有极强吸 附力（近 100%）的硝酸纤维素（NC）膜,此外酶作用底物后形成有色的沉淀物,使 NC 染 色；【技术要点】1、抗原包被膜：加少量（12 L）抗原于膜上；由于NC 膜吸附力强,故需在包被后进行封闭；2、抗原抗体反应：滴加样品血

38、清,其中的待检抗体即与 酶标二抗；NC 膜上抗原结合；洗涤后再滴加3、显色反应：滴加能形成不溶有色沉淀的底物溶液（如HRP 标记物,常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上显现肉眼可见的染色斑点；【方法评判】斑点 -ELISA 的优点为： NC 膜吸附蛋白力强,微量抗原吸附完全,故检出灵敏度可较一般ELISA 高 68 倍； 试剂用量较 ELISA 约节省 10 倍；操作简洁, 试验及结果判定不需特别设备条件；吸附抗原（抗体）或已有结果的NC 膜可长期储存（-20可长达半年） ,不影响其活性；免疫印迹试验（IBT ）亦称酶联免疫电转移印迹法（EITB ）,通常又称 Western-blot；【原理

39、】 是一种将高辨论率凝胶电泳和免疫化学分析相结合的技术,具有分析容量大、 敏锐性高、 特异性强等优点,是检测蛋白质特性、表达与分布的一种常用方法,如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等；名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 【技术要点】1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经 SDS 处理后带负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极涌动,分子量越小, 涌动速度就越快；此阶段分别成效肉眼不行见（只有染色后才显出电泳区带）；2、电转移：将在凝胶中已经分别的条带转移至硝

40、酸纤维素膜上,选用低电压（100V）和大电流（ 12A ）,通电 45min 转移即可完成；此阶段分别成效肉眼仍不行见；3、酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标其次抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色；常用的 HRP 底物为 3,3-二氨基联苯胺 （呈棕色）或4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色） ；阳性反应的条带清楚可辨；并可依据 SDS-PAGE 时加入的分子量标准,确定各组分的分子量；【方法学评判】1、抗体的性质： 影响本试验成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体时别的表位的性质；只有那些能识别耐变形表位的抗体可与抗原

41、结合,所以在该试验中常选用多克隆抗体；2、IBT 的灵敏度：一种是在电泳之前应用免疫沉淀法将抗原进行纯化和浓缩；其他方法都是针对增强信号本身设计的,强等；包括使用信号更好和更强的荧光实际或使条带局部酶的活性增3、IBT 法在临床应用中存在肯定局限性；非标记抗体酶免疫组织化学染色第一用酶免疫动物,制备效价高、 特异性强的抗酶抗体,通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起；该方法防止了酶标记时对抗体的损耗,同时也提高了方法的敏锐性【技术类型】（一）酶桥法抗酶抗体作为第三抗体,通过桥抗体（其次抗体）将特异性识别组织抗原的第一抗体连接,形成酶联的 抗原 -抗体 复合物,加底物显色；本法较酶标法的敏

42、锐性有所提高,但操作分四步较为复杂；（二）过氧化物酶抗过氧化物酶酶（PAP）法是在酶桥法的基础上加以改良；本法第一将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体） 与酶组成可溶性复合物（ PAP 复合物）；该复合物由两个抗酶抗体和三个过氧化物酶分子组成,呈五角形结名师归纳总结 - - - - - - -第 10 页,共 12 页精选学习资料 - - - - - - - - - 构,特别稳固；通过桥抗体（其次抗体） ,将特异性识别组织抗原的第一抗体与 起来,此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同PAP 复合物的抗酶抗体连接与酶桥法相比, PAP 法操作简便,分三步；PAP 复合物结构稳固,防止了酶桥法中标

43、记易脱落的弊端；敏锐性高；背景着色淡,由于即使桥联抗体存在有非特异性抗体的可能,但因其与第一抗体并非同种属,故不能与抗酶抗体结合；并且, 假如抗酶抗体中存在着非抗酶抗体,当其与桥抗体或组织成分结合时,由于其不能与酶结合,也不会产生非特异性反应；（三）双桥PAP 法PAP 法中通过两次连接桥抗体和PAP 复合物该法建立在PAP 法的基础上； 其基本原理是在而建立起来的,通过双桥可结合更多的PAP 复合物于抗原分子上,以增强敏锐性；这种放大方式重复使用桥抗体,使桥抗体与PAP 复合物中抗酶抗体的未饱和Fc 段结合,或桥抗体与特异性第一抗体未饱和的 原的检测又有用价值；Fc 段结合；如此对抗原有明显

44、放大作用,对于组织细胞微量抗（四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP ）法因部分组织细胞内含内源性过氧化物酶,限制了HRP 的广泛应用,需选用其他酶免疫组织化学反应；本法是用碱性磷酸酶（ALP ）代替 HRP 建立的碱性磷酸酶（ALP ） -抗碱性磷酸酶（ AAP ）法,简称 APAAP ；其技术要点与 PAP 法相像；【常用酶及显色底物】最常用的是辣根过氧化物酶（HRP ）,常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB ）,反应产物呈棕色其他有：氨基乙基卡巴唑（AEC）,反应产物为橘红色；4-氯 -1-萘酚,反应产物为灰蓝色；碱性磷酸酶为磷酸酯的水解酶,可通过两种反应显色：偶氮偶联反应,最终与重氮化合物作用生成不溶沉淀,如快蓝为深蓝色,快红为红色；靛蓝四唑反应,最终形成紫蓝色不溶沉淀