多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种.pdf

《多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种.pdf（7页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、生物工程 艮品科学 20J8,V0139,No02 163多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种陈文炳，邵碧英，缪婷玉，彭娟，陈彬，张志灯，江树勋(福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州 350003)摘要：建立6种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板，采用3对通用引物对6种鳗鱼的3个基因(16S rRNA、Cyt b、CO，)部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序，结果6种鳗鱼各获得3条16S rDNA(638643 bp)、cyt b(464466 bp)、COI(705707 bp)基因部分DNA序列，从中选取各物种序列同

2、源的片段设计3对新引物对6种鳗鱼的16S rRNA、cyt 6、COI基因部分DNA片段进行PCR扩增，其产物大小分别为504507、400、609 bp，再从各片段中筛选出具有6种鳗鱼物种特异性强的、碱基数分别为262、280、300 bp的3条DNA片段序列，作为6种鳗鱼物种的3个基因的标准DNA条形码，应用DNAMAN V6软件进行同源性分析，并通过GenBank数据库的比对验证，制定了供检测实践用的同源率判别指标，建立鳗鱼物种的多基因条形码检测方法。应用该方法对30个待检鳗鱼样品进行检测，结果表明，各样品基于3个基因DNA条形码的比对，符合同源率指标，物种判别结果互相吻合，从而精准判别

3、样品的所属物种。该方法稳定、精准、易于操作，可应用于6种鳗鱼的物种鉴定，值得推广。关键词：16S rRNA基因；cyt b基因：CO I基因；多基因DNA条形码；鳗鱼物种鉴定Identification of Six Eel Species Using Polygenic DNA BarcodingCHEN Wenbing，SHAO Biying，MIAO Ting”，PENG Juan，CHEN Bin，ZHANG Zhideng，JIANG Shuxun(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Techno

4、logy Research，Inspection and Quarantine Technology Center,Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Fuzhou 350003，China)Abstract：ms paper develops an accul甚te method to identify six eel species including Anguilla rostrata，Aanguilla，Ajaponica，Amossambica，Amarmorata，and Abicolor pacifica usin

5、g polygenic DNA barcodingThree pairs of universalprimers we化used to amplify partial fragments of the 1 6S rRNACyt b and CO I genes of the eel species with the totalgenomic DNA from eel鹳a template and the amplified products were sequencedAs a resulL 16S rDNA(638-643 bp)，cyt b(464_466 bp)and CO I(705-

6、707 bp)gene fragments were obtained for each speciesHomologous sequences of thesegenes were foundThree new primer pairs were designed to amplify 638-643，400 and 609 bp fragments of the 16S rRNA，Cyt b and CO I genes by PeR,respectivelyThe specific 1 6S rRNA，cyt b and CO，fragments of 262，280 and 300 b

7、pwere selected as standard DNA barcodes for the identification of eel speciesHomology analysis WaS performed usingDNAMAN software(version 6、and the homology for species discrimination WaS developed by aligning the DNA barcodeswith the GenBank databaSeAnalysis of 30 samples from six eel species by th

8、e developed method showed that the specieswere consistently identified using the DNA barcodesIn conclusion,the method is stable，precise and eaSy to operate and Callbe applied to the identification of six species of eelsKeywords：16S rRNA；Cyt 6；CO I；polygenic DNA barcode；identification of eel speciesD

9、OI：107506spkxl0026630-201802026中图分类号：$9174；Q78 文献标志码：A 文章编号：10026630(2018)02016307引文格式：陈文炳，邵碧英，缪婷玉，等多基因DNA条形码鉴定6个鳗鱼物种【J】食品科学，2018，39(2)：163-169DOI：IO7506spkxl0026630-201802026http：flwwwspkxnetcnCHEN Wenbing,SHAO Biying，MIAO Tmgyu,et aL Identification 0f si】【eel sp优i髂using polygenic DNA barcedingJFoo

10、d Science,2018，39(2)：163169(in Chinese with English abstrac0 DOI：107506spkxl002-6630-201802026http：HwwwspkxneLcn我国是鳗鱼养殖与加工出口大国，每年烤鳗与活鳗出口量达数万吨，货值达数十亿美元，主要出口国有日本、美国、俄罗斯、德国、韩国等。由于鳗鱼加工成熟食以后及进口鳗苗体积细小，难以从形态上辨别其种收稿日期：20170602基金项目：福建省科技计划农业引导性项目(2015N0016)第一作者简介：陈文炳(1962一)，男，研究员，博士，研究方向为农产品、食品分子生物学检测技术。Frl础

11、-621213wbc163oom万方数据164 2018,V0139,No02 良晶科学 生物工程类。一方面不同种类的鳗鱼产品与鳗苗价格不同，另一方面，欧洲鳗(Anguilla anguilla)被自然保护国际联盟组织列为极度濒危物种”之l，所有的欧洲鳗国际贸易都需要获得濒危物种贸易许可证。我国鳗鱼产品出口时，被进口国要求提供鳗鱼物种鉴定报告，如果产品物种属于欧洲鳗，又未能提供贸易许可证，将被视为非法贸易而被强行销毁处理。另外，近年来时有发现不良商家用在我国气候条件下无法正常生长成成品鳗的莫桑比克鳗苗冒充“南美鳗”，给养殖企业造成巨大损失。为了维护企业与消费者利益以及正常市场秩序，应企业与执法

12、部门要求，建立鳗鱼种类的精准鉴定方法，对我国鳗鱼养殖业与加工出口外贸易具有重要的现实意义。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增技术在食品中鱼类物种成分的鉴别已有较多研究与应用【37l，在鳗鱼中的应用主要是基于PCR的随机扩增多态性DNA遗传多样性分析与物种鉴别探讨的研究喁1 21，但在检验检疫中实践应用，缺乏稳定性与准确性。DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，种间存在足够变异，种内相对稳定，易于PCR扩增、适当长度的DNA片段。最早由加拿大生物学家Hebert等纠研究发现利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(mitochondrialcytochr

13、ome C oxidase subunit I，CO I)基因一段长度为648 bp的片段，能够在DNA水平上成功的区分物种，提供一种快速、简便、可信的分类方法，并命名为DNA条形码技术。近年来，随着基因条形码技术的发展，除了CD，基因DNA序列作为标准条形码应用于物种鉴别【13”1外，存在物种特异性的线粒体16S rRNA、Cyt b基因、COII基因等的DNA序列，也被作为DNA条形码应用于物种鉴别和遗传多样性分析“211，国内有关于鳗鱼线粒体DNA的CO I与COII基因序列分析及其系统分类的研究【22。241报道。国外有人将鳗鱼CO，基因序列的DNA条形码与GenBank中鳗鱼DNA序

14、列比对，而判定非法贸易的欧洲鳗物种，但该方法往往存在待测样品与GenBank中多个鳗鱼物种同源率相同，难以准确判断其所属具体物种幢52 61。目前国内外鲜见利用多基因DNA条形码进行鳗鱼物种鉴定的研究报道。本研究在基于16S rRNA基因部分DNA片段建立的DNA条形码(243 bp)鉴定美洲鳗(Anguilla rostrata)、欧洲鳗(4anguilla)、日本鳗(彳japonica)3种鳗鱼的基础口”上，延长16S rRNA基因部分DNA片段为262 bp并筛选除了Cyt b基因与CO I基因等多基因的标准DNA条形码，建立了美洲鳗、欧洲鳗、日本鳗、莫桑比克鳗(Amossambica)

15、、花鳗(彳marmorata)、太平洋双色鳗(彳bicolo，pacifica)6种鳗鱼的多基因DNA条形码物种精准鉴定方法。为维护企业与消费者利益以及正常市场秩序，避免贸易壁垒，提供技术保障，对我国鳗鱼养殖业与加工出口对外贸易具有重要的现实意义。1 材料与方法11 材料与试剂日本鳗、美洲鳗、欧洲鳗样品，由福建省三明市华晟食品公司提供，莫桑比克鳗、花鳗(彳marmorata)、太平洋双色鳗样品由福州郊区鳗鱼养殖企业提供。用于方法应用实验的待测鳗鱼样品系企业委托实验室留样与鳗鱼养殖企业提供，制作成模拟盲样供实验。十六烷基三甲基溴化铵 上海博亚生物技术有限公司；2Taq PCR Master Mi

16、x、蛋白酶K、DNAMarker I 天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖英国Oxoid公司。12 仪器与设备Ultrospec 1 100 pro核酸蛋白分析仪 瑞典Amersham公司；TGradient梯度PCR仪 德国Biometra公司：Power Pac 1000电泳仪 美国BioRad公司；GL212 PRO凝胶成像仪 美国Carestream公司。13 方法131 引物设计16S rRNA、Cyt b、CO 1基因的3个DNA部分片段PCR扩增通用引物序列旺8。州与自主设计的DNA条形码引物序列(16S rDNA 504、Cyt b 400、COI 609)、退火温度与PCR产

17、物长度见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。表1 通用PCR引物与自主设计的引物序列、退火温度及PeR产物Table 1 Primer sequences for PCR amplification of 16S rDNA，o口b，and CO I genes，annealing temlramres and PCR product size132 DNA的提取及浓度、纯度测定参照文献27】方法进行。15 mL离心管中加入约50 mg样品粉末或鲜样100 mg，加200 pL TE溶液(pH 80)，旋涡混匀；加入400 pL裂解液，旋涡混匀；jn600 IxL Tri饱和酚氯仿异戊

18、醇溶液(25：24：1，刀矿)，剧烈振荡，12 000g离心10 min；取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇溶液(24：1，VV)，剧烈振荡，12 000g离心10 min；取上清液，加08倍体积异丙醇，12 ooog离心lO min；取沉淀，加入400 pL NaCI溶液(1 molL)于65温浴中溶解，再加入5止蛋白酶万方数据生物工程 艮品科学 2018,V01jg,No02 165K(20 mgmL)，5 gL Rnase A(10 ggmL)，剧烈振荡30 S以上，37温浴1 h，期间定期晃动。加等体积的水饱和酚氯仿异戊醇溶液(25：24：1，VV)，振荡，12 000 rmin离心15

19、 min，重复该步骤l2次，直到蛋白质去除干净为止。取上清液，JJn2倍体积的无水乙醇，轻微晃动，12 000 rmin离心10 rain。取沉淀，70乙醇溶液清洗2次，干燥，加100此TE(pH 80)溶解。每个样品设2个重复。样品DNA用核酸蛋白分析仪测定波长260 nm和280 nm处的OD，分别计算DNA纯度与质量浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260 lamOD280n。，比值在1720之间较为理想；双链DNA质量浓度(ggmL)=50OD2印。值。133 PCR反应热循环参数的设置与PCR反应体系PCR扩增条件：94预变性3 rain。94变性30 s，5062(各对引物相应温

20、度见表1)退火时间30 S，72延伸60 S，40个循环；72延伸10 min。4保存。反应体系为：10X忍g buffer 25此，Taq酶10 U，模板DNA 200 ng，MgCl2 35 mmolL，dNTPs 300 IsmolL，上游引物05 gmolL，下游引物05 gmolL，用ddlt，O将总体积补至25 uL。134 PCR扩增产物的电泳检测用05TBE电泳缓冲液制备质量分数2的琼脂糖凝胶。将810lL的PCR扩增产物分别与12 pL的6加样缓冲液(电泳前沿指示剂)混合后，在凝胶板上的孔中点样。用分子质量大小适当的DNA Marker做分子质量标记。选择合适的电压(8090

21、 V)，电泳时间为5060 min。用凝胶成像仪观察、拍照、记录与分析。135 PCR扩增产物的DNA测序与分析PCR扩增产物委托铂尚(Biosune)生物技术(上海)有限公司进行双向测序，各基因片段序拷贝在word格式文档中，序列首尾各用相应的8个碱基小片段作为查找的引子，截取特异性目的片段，作为各鳗鱼物种标准DNA条形码，供比对鉴定。用DNAMAN V6(中文版)进行DNA序列整理，以枣seq格式输出，然后进行同源性比对与同源树构建，比对结果与同源树以+erllf格式输出。2 结果与分析21 鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、CO I基因片段PCR引物筛选及其产物序列分析采用3对通用引物

22、(表1)对6种鳗鱼的3个基因(16S rRNA、Cyt b、CO，)部分DNA进行PCR扩增，PCR产物双向测序，6种鳗鱼各获得3条16S rDNA、Cyt b、CO I基因部分DNA序列，片段长度分别为638643、464466、705707 bp，在GenBank数据库中BLAST比对，分别与数据库中的美洲鳗、欧洲鳗、日本鳗、莫桑比克鳗、花鳗、太平洋双色鳗的相应基因序列的同源率均为99，序NID号见表2。基于各基因的6条序列的同源性比对，Cyt b基因部分图见图1(16SrRNA与COI基因图略)，排除序列中存在碱基缺失部分与不具差异的区间，选取各物种序列同源的片段(图1，下划黑线部分)用

23、于设计新引物(16S rDNA 504、Cytb400、COl609，表1)。美洲鳗欧洲鳗日本鳗莫桑比克鳗花鳗太平洋双色鲤麸有宁列美洲鳗欧洲鳗日本鲠莫桑比克鳗花鲠太平洋双色鲤共有串列美洲鳗欧洲鳗日本鳗莫桑比克鳗花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲鳗日本鲠莫桑比克鳗花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲鳗日本鳗莫桑比克鲠花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲鳗日本鳗莫桑比克鲤花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲鳗日本鳗莫桑比克鳗花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲鲤日本鳗莫桑比克鳗花缨太平洋双色鳗共有序列美洲鳗欧洲终日本鳢葵桑比克鳗花鳗太平洋双色鳗共有序列美洲鲤欧洲鲤日本鳗莫桑比克鳗花鲠太平洋双色鳗共有序列美

24、洲鲠欧洲鳗日本鳗莫桑比克鳗仡鳗太平洋双色鲤共有序列美洲鳗欧洲鳗日本鳢奠桑比克鳗花鳗太平洋双邑鲠cM gtt筘cccqt口口tm啾一ItcttTT TT7GtTTTGG TT7T T TT7kTTiT丁-1=Tt；TT*；r二 僵：1二cj置TT善：T1j。T ；门T Trl叠：G：舸T署T1o：rT I：。Tj鲁r：0椰Tj昏1T一 rT“1rT：，+i僵+T-；垢TT一：导：下一一一rT，?0从T?17jj一1T1蛋1ij一；五 一誊曩量瞳田宙圈一t ttc tc哪t tcctgct唧一a删c口螂tq口口t口cttttcccttgtattt4ic gcectcgtt口g t钟，。二望兰立兰二

25、三翌2二2二二二川-I划1 6种鳗仃l()r b J是【叫占：纾D、A”段(464466 bp)#们J比埘玳g1 Squen(拍44硒bp)aliment of O6 gene fragm蛐虹among 6 eel sp盹i鹤万方数据166 2018,V0139,No02 食品科字 生物工程表2 6种鳗鱼的16S rDNA、Cytb、CO，基因通用引物PCR扩增产物序列在GenBank中对应的同源率最高的DNA序列号Table 2 GenBank DNA sequence accession numbers with the highesthomology t0 PCR amplified p

26、roducts谢恤universal primers of the16S rDNA，CytbandCO，genesofsixeel研Ied皓供蓊嚣鱼慧彗等篙羔墅兰塑；詈塑旦婴紫” (638643bp)(464466bp)(705707bp)22 鳗鱼DNA条形码标准序列的筛选与在GenBank数据库中比对(BLAST)分析A图2 6种鳗鱼16S rRNA基因(A)、076基因(B1和CO，基冈(c)的3条DNA段(504507、400、609 bp)PCR产物电泳图rig2 PCR衄l删resultsofthreeDNAfragtmmts(504-507,400,and609bp)ofl6Sr

27、RNA(A)Cytb011)andCOI(o窖e雌缸6即bofed应用自主设计的3对引物16S rDNA 504、Cytb400、CO I 609(表1)对6种鳗鱼进行PCR扩增与测序，如图2所示，从各序列中筛选、截取6种鳗鱼间碱基序列同源性低、物种特异性强、不存在碱基缺失或插入的片段，作为6种鳗鱼的16S rRNA、cyt b、C01 3个基因标准DNA条形码，片段长度分别为262、280、300 bp，如图3所示，各物种序列相同的首尾下划线部分8个碱基为截取目的片段的引子，用于在word文档中“编辑查找”(参照文献27】)。6个鳗鱼物种各3个基因共1 8条DNA条形码碱基序列在GenBan

28、k数据库中检索比对(BLAST)的结果(按同源率高低排序显示出100条)，如表3所示。除太平洋双色鳗外，日本鳗、美洲鳗、欧洲鳗、莫桑比克鳗、花鳗的DNA序列匹配(同源)率除了个别情况，均为99100。在16S rDNA条形码碱基序列比对中，欧洲鳗样品的DNA条形码在GenBank数据库中比对与一个Arostrata(105642711)片段同源率为100，可能是序列提供者提交时弄错种名。样品莫桑比克鳗的Cyt b(280 bp)DNA条形码比对中，出现与一个印度洋双色鳗(彳bicolor bicoIo，)(AB0217801)片段同源率是100，也可能是序列提供者提交了错误的种名。另外，在供试

29、样品太平洋双色鳗的3个基因DNA条形码与GenBank数据库比对中发现，供试样品与印度洋双色鳗物种亲缘关系非常接近，16S rDNA条形码碱基序列比对中，同源率为100的，排序前面100条片段中，前6个片段是太平洋双色鳗，接在后面的是82条印度洋双色鳗，同源率为99的12条也都是印度洋双色鳗；在Cyt b(280 bp)DNA条形码比对中，同源率为100的16个片段都是太平洋双色鳗，同源率99的57条中，太平洋双色鳗占23条，印度洋双色鳗占34条，余下同源率98的27条也均为印度洋双色鳗；在样品太平洋双色鳗的CO I(300 bp)DNA条形码序列与GenBank数据库比对中发现，同源率为10

30、0的只有1条片段(爿bicolo，pacifica，AP0072373)，其他99条均是同源率为98的印度洋双色鳗。综合上述分析结果，本研究归纳出6个鳗鱼物种的3个基因标准DNA条形码序列应用于鳗鱼物种鉴别实践的同源率判断指标如表4所示。例如，某盲样3个基因的序列与美洲鳗标准DNA条形码同源率均为99100，可判定该样品为美洲鳗，如果与莫桑比克鳗(彳mossambica)标准DNA条形码16S rDNA(262 bp)与cyt b(280 bp)的同源率均为99100，与CD 1(300 bp)的同源率为100，样品可判定为莫桑比克鳗：某盲样3个基因的序列与太平洋双色鳗(4bicolorpac

31、ifica)标准DNA条形码同源率均为100，可判定该样品为太平洋双色鳗。AI美洲鳗l量卫匝g鱼T6GGG6c1T兀CTTrCCCCCATGGTCGCCCCAACCGAAGACA T11GTcG6l丁几CGTICGrnTGTGGC C1TCGTGllCnlTOGlTGrnloGlTrCllTACATGTT12I TOATC门11G1CTAAAGCTCCATAGGGlCTTClGTCTTATGTAllTAT01rCGmCTGI引 CACG6GoCAGATCAAr兀ATTGACTGGGGGAAGGAGACAG TTAAACCCTCGTTTGCCAT241 TCATACAGGT芷旺I世2歇洲gQ口强

32、TG00。(T111TYTCCCCCATGGTCGCCCCAACCGAAGACAITAGATCAG6l 1TrACGTTGGOr兀1GTGGCCrrCGTOTTCf几TrGGTTGOr几bGllTC T1TACATGTT121 TGTa广r1181、CTAAAGCTCCATAGGGTCTTCTCGTCrTATGTGlTrATGTCC0c一广TcTG181 CACGGGCAGATEAATlrcATTGACTAGGGG AAGGAGACAGIAAACCCTCGrrTGCCAT241 TCATACAGGTcTcT芷迭丛3日本馒I正g毯TG0003C盯11TTCTCCCCCATGGTCGCCCCAAC

33、CGAAGACATTrGGATCAG61 TFrACGTCGGGTrTCGTGGCC兀ToTO竹cC丌丌GGTTAACTTGGT丌cmACATGIT121 TGA T】。11rrGTCTAAAGCTCCATAGC站TcTTCTCGT订TATGTAmATGTCCGCTTCTG181 CACGCAGAlchmlcnTGACTAGGGGAAGGAGACAGTTAAACCCTCGlTrATGCCAT24l TCATACAGGTcTCT1丛4真叠比克鳢 a=g砸TOGGGGCITFrCTCTCCCCCATGGTCGCCCCAACCGAAGACATFrGGATCAG61 TTTACGTTGGGTTTTGT

34、GGCf几TGW研CC几rroGllGa兀1啪rrTC_兀TCTG丌121 TGTcTlllTCTAAAOCTCCATAGGGTCTTCTCGTCITATGlbr丌T6TCCGCITCTG181 CACCJGCXAGATCAATrFCATTGACTA00GoAAGGAGACAGTTAAACCCTEGTrATGCCGT241 TCATACAGGT正吐址，花螺I立口譬CDQQTGGGGGclT丌c TTTCCCCCATGGTCGCCCCAACCGAAGACA T1TrGtcT61 mCGTTd3GITrTGTGGCC兀TGTGTTCf兀110G11DGm03mC rrrCTGTT12l TOtcl

35、T丌DTCTAAAGCTCCATAGGGTCTTCTCGTCTTATGTGTTTATGTCCGCFrCTG181 CACGGGCAGATCAATTTCATTGACTGGGGGAC,GGAGACAGIrAAACCCTCGTTATGCCAT241 TCATACAGGTCTCTA皿A址6太早洋双色蜢I g口g：【QQTOGGGGl3TTTCTTCCCCCATGGTCGCCCCAACCGAAGACATTTGGATCAT61 TTTACGTCGGGm聊册他TTc呷oG丁TAG丌TGGTTTC丌TCTG丌121 TOATclT丌UTCTAAAGCTCCATAGGGTCTTCTCGTcllTGtT1TTGT

36、CCGCTTCTG181 CACOGGCAGATCAATTTCATTGACTAGGGGACC晒AGACAGTTAAACCCTCGTTATGCCAT241 TCATACAGGTCTCT苴旺n址万方数据生物工程 食品科学 2018,V0139,No02 167Bi羹洲舅2欧洲鳢，口奉奠6口旺E西1TCIICrAGGATrTGn?rrTrCACAAATCCVfACAGGAmlTccTGCCATACATrA TACATCAGAC矾I口cnGcCnClcCTc AGTAGCTCACATCTGCCGAGACGTCAACTATGGATGATTArrcGC从CCTACATGCAAATGGGGCCTCAr兀1T

37、f几1T嘞ATACCTTCACATTGCCCGAGGACr几CTC05CTCTTmTACAAAGAAACATGAAACATTGGAGTCGTA兀T1cTTTg随盘丛工丑!iQTcH丌cTGGAllTGrmTTTCACAAATCCTTACAGGA cTATTccTGCCATACATfATACATCAGACAlCTCAACTGCcTTcTcCTCAGTAGCTCACATCTGCCGAGACGTCAACTATC赫ATGACTAATrcCCAACCTACATGCAAATGGGCJCCTCATrCTC兀TTCTCCCTATACCTCCACATrGCCCGAGGGcl耵ACTACGGCTCATACCTTT

38、ACATAGAAACATGAAACATTGGAGTTGTAnrrccTATT虹丛龇I虹避TcTCTCCTAGGACTATGCCTTA TTTCGCAAATCCTTACAGGATTATKcTG61 CAATACACTACACATCAGAC1TrC从CT6CC九TTCCTCAGTAGCCCACATCTGCCGAG121 ACGTrAAYiATGGATGATFCATCCGAAATfTACATGCAAACGGGGcCTCC T1。C丁rfnlA181 TCTGCCTCTACCTACACATTGCCCGAGGAC兀TcTACCTCATACcTTTC从GAM241 CATGAAACATc66G1TnT1c

39、TTT虹勘勘缸4其晕比克鲤 A口工噬TcTcTccTAOGCTATGTCTTATCrC-rCAAATCCrTACAGGAcTG丌ccTAG61 CCATACACTACACATCAGACAr九AACTGCC兀TrCcTcAGTACCCCACATCTGC CGAG121 ATGVrAACTATGGrGTTAATCCGTAACCTACATGCAAATGGAGLWTCTTTCrrC兀。CA18l T咖CTACCTCCAC1TGCCCGAGGACr几CTACG6CTCATAn丌TACAAAGAGA241 CATGAAACATCGGAGTIGTA丌丌ccTTTA卯A虹牲I5芘鳋1卫工r盟TcTCTCCTA

40、GGATfATGCCTAATCTCACAAATCATCACAGGACTAIqCCTAG61 CCATACACTACACATCAGACATCTCAACTGCC兀11CCTCAGTAGCCCACT兀乜CCGAG12I ACGIrAATIAC001bCTATCCGCAACTTACATGCAAACGGGCCTCCrrcTnTrCIBI TCTGCCTATACCTTCACTTGCCCGAGGACTTTCTACGGllTTCTTTCAAAGAAA241 CATGAAACATCGGAGTCGTA cTAlTccTTT正工丛墅E丛6太平洋取色篡I筮妇jQ篮TC TcTccTOGITATGCCTIATCTCAC

41、AAATCGTTACAGGAcTATl口=TAG61 CCATACACTATACATCAGACAlllCAACCGCcTTCTCCTCAGTOCCCTAr广rGCCGAG121 ACG丌AACTACGGATGACTAATCCGCAACCTACATGCAAACGGAGCCTCArrCrrCnI引r丌唱TcTTCCTCCACATCGCCCGAGGACr厂rCTACGGATCATrcTTTATAMGAA241 CATQAAACATCGGAGTCGTAcnTTccrATTA虹丛幽Cl美洲赣 Q匿叠A研TAGCCCACGCcGGoc1、cTGTTGACCrGAcMTlTrcTACITCACCTT61 o

42、CA06丁丁C丁CATCAArrCTAGGGGCCA下TAAr兀T11CTACAA丌TTAAC ATGAAA12I CCGCCTC记AATfACACAATACCAAACfCCCCrGllGTATGG(瞄TATrAGTACCGCT181 GTrCTGCTACTCCTCTCCCTGCCAGTCCTAGCCGCAGGCAn垃nnlnAACTGAC241 CGAAATCTAA ATACAACCTTCTTTGACCCTGCAGOCCTG GGGACCCAATCC丛3A丛丛2欧洲鳗Q妇墨亟I丛cTTAGCCCACGCCGGGCCATCTGTTGACCTGAc11TrcwACTCCACCTT61 0COGT

43、11TCATCAArrCTAGGGGCCArTAACTTTArrcTAC从TCTTAACATGAAA121 CCGCCrGCAAnCACAGTACCAAACrCCC吼试n吼蛆GAGCrGTA=n AGTAACCCrCC181 0r兀10CTACTCcTCTCCCTGCCAGTCCTAGCCGCAGGCATfACAATACTTCTGACTGAC241 CGAAATCTAAATACGACCTTcllTGATCCTCrCAGCJGGGTGGAGACCCAATCCIf了丛：丛3日本囊 Q皿g幽cTTAGCCCATGCcGGAGcATcTGTTGACCTGACAATCTITTCACTICACCTT61

44、GCAGGGK陬CATCAATCCTAGGGGCcnAATm：nKCTACk：nnTAATATGAA G121 CCGCC弼CC1-rCACAGTACCAAACCCCACTG丁兀TATGGcTGr兀T0TTCC唧181 GTITACTACl瓯KTCCCTGCCAGTCCTAQch0吼kTrACAATACTTCTAACTGAC241 CGAAATrrAAATACAACCrrCTTTGACCCTGCAGGOGGTGGAGACCCAATCC卫口强匹：丛4其曩比克鳗l g了姑诘ATAGCCCACGCCGGCGCATCTGmAccT从CMTTITcTCACTTCACCTC6t GC00从1TTCATCA

45、ATTCTAAGCCAfirAATllT丌CTACAATCATTAACATGAAA121 CCCCCHTCACACAGTACCAAACCCCTCTG丁几研TGAGCTGTrrrAGTAACCGCT181 GTTCTACTACTCCTATCCCTGCCAGTCCTA00coCoGTTrACAATACTllCTAACTGAC241 CGAAACCTAAACACAACA竹c兀TOACCCTGCAGGGGGTGGAGACCCAATCC卫a6鼬5花j叠口鼙血厶柙TAGCCCACOCcO“GcTcTOTTGccToc从T111OCTrCACCTT61 GC00ATTTCATCAATCCTAGGGGCCAT

46、TAAlTrrTcCTACAATIATT从CTOAAA12l CCGCCTGCCAn黼k峨kCCAAACCCCT吼吼n饥蛆GAGCTG讯AGTCACCGCT18I GTTCTC1CTCCTATCCCTACCAGTCCTAGCTGCAGoTAllC从TCTTCTGACTGAC241 CGAAACTTAAATACAACCTTCTTTGACCCTGcoOOOTGGAGACCCAATCC皿g：AA6太平洋飙色螺g了魁玷山TTAGCCCATC虻TGGAGCATCTGTCGACCTGAcT1TrcTcACTTCACCTT61 GCAGGAGTTTCATCAATCCTGoGGoCCA仃T兀TT1cTCT1。

47、TCAACATGAAA121 CCGCCTC,CCATTACACAATACCAAACCCCTClGnfTGAGCTGTrrlAGTCACCGCT181 GTrCTGCrAClCC【1CCClGCCAGTCCTAGCTGCAGGAATTACGATACTTCTGACTGAC“l CGAAACTTAAATACAACATTCTITGACCCTGCAGGACGCGGAGACCCAATccI【了酗：丛图3 6种鳗鱼的16s堰NA基因(A)，Of6基因(B)fnco，基因(c)的3条DNA条形码(262、280、300 bp)标准序列Hg3 Three standard DNA barcode sequences(262，瑚，and 300 bp)based oR 16S rRNA(A)，0口6)and CO J(C)gene frasments h6 st喇,du ofeel表3 6个鳗鱼物种的3个基因共18条DNA条形码碱基序列在GenBenk数据库中比对的结果Table 3 Alignment of 18 DNA1quoKle sequences from 3 genes in6 eel specks with the GenBank databaseDNA 供试鲠鱼 壁型堕垦!旦蔓2奎 其他物种条形码 物种 100 99 (498)美洲鳗 鹌 52 0欧洲鳗 57(+l)42 016