联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究.pdf

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1、联 合 应 用 凋 亡 素 基 因 、 新 城 疫 病 毒HN基 因及IL-18基 因 对 黑 色 素 瘤 的 抑 制 效 应 研 究!李 霄 金 宁 一 米 志 强 连 海 孙 迎 春 李 杰!管 国 芳!（ 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 基 因 工 程 重 点 实 验 室 长 春 130062）（!吉 林 大 学 第 一 医 院 血 液 肿 瘤 科 长 春 130021）（!吉 林 大 学 第 二 医 院 耳 鼻 喉 科 长 春 130041）摘 要 以 前 的 研 究 结 果 表 明 ， 来 自 于 鸡 贫 血 病 毒 的 凋 亡 素 基 因 、 来 自 于 鸡

2、 新 城 疫 病 毒 的HN 基 因 和 IL-18 基 因 具 有 不 同 的 抗 肿 瘤 效 应 ， 但 上 述 基 因 抗 肿 瘤 的 机 制 不 同 ， 本 研 究 在双 启 动 子 真 核 表 达 质 粒 pIRES 中 的 CMV 启 动 子 下 游 插 入 凋 亡 素 基 因 ， IRES 启 动 子 下 游 插入 IL-18HN 嵌 合 基 因 ， 构 建 能 同 时 表 达 三 种 基 因 的 真 核 表 达 质 粒 pIRVP3IL-18HN。 复 制C57BL/6 小 鼠 荷 黑 色 素 瘤 模 型 ， 并 将 质 脂 体 包 裹 的 重 组 质 粒 进 行 瘤 内 注

3、射 ， 共 注 射 3 次 ，每 次 100Pg 质 粒 ， 拟 观 察 凋 亡 素 、 新 城 疫 病 毒 HN 基 因 和 IL-18 基 因 以 核 酸 疫 苗 的 形 式 联合 应 用 对 小 鼠 黑 色 素 瘤 的 抑 制 效 应 。 结 果 显 示 pVIL-18HN、 pVIL-18 和 pVVP3IL-18 均 有 抑制 肿 瘤 作 用 ， 但 pIRVP3IL-18HN 组 抑 瘤 率 高 于 pVIL-18HN 组 、 pVIL-18VP3 组 、 pVIL-18 组 和Hanks 液 对 照 组 。 研 究 结 果 提 示 ， 上 述 3 种 基 因 联 合 应 用 具

4、有 协 同 抑 瘤 效 应 。关 键 词 凋 亡 素 基 因 ， 新 城 疫 病 毒 HN 基 因 ， IL-18 基 因 ， 联 合 抗 肿 瘤 效 应0 引 言目 前 肿 瘤 基 因 治 疗 已 成 为 基 因 治 疗 和 肿 瘤 治 疗领 域 内 研 究 的 热 点 ， 已 获 批 准 用 于 临 床 的 基 因 治 疗方 案 中 ， 约 60%以 上 针 对 肿 瘤 。 肿 瘤 基 因 治 疗 的 方法 主 要 有 ： 抑 制 癌 基 因 的 治 疗 方 法 ； 提 高 机 体 对 肿 瘤细 胞 免 疫 清 除 的 治 疗 方 法 ； 直 接 将 “ 自 杀 ” 基 因 或 诱导 凋

5、亡 的 基 因 导 入 肿 瘤 细 胞 的 治 疗 方 法 ； 抑 制 肿 瘤细 胞 耐 药 基 因 的 治 疗 方 法 等 。 尽 管 上 述 基 因 治 疗 在体 外 或 实 验 动 物 体 内 都 取 得 了 较 好 抑 瘤 效 果 ， 但 用于 临 床 研 究 却 大 多 效 果 很 不 理 想 ， 其 原 因 在 于 肿 瘤较 高 的 异 质 性 是 多 阶 段 多 因 素 相 互 作 用 的 结 果 ， 单一 因 素 的 纠 正 往 往 达 不 到 较 好 的 抑 制 效 果 。 由 于 基因 治 疗 自 身 的 特 点 ， 使 之 很 容 易 同时 携 带 多 种 基 因 ， 因

6、 此 ， 人 们 尝 试 将对 肿 瘤 有 不 同 抑 制 作 用 的 基 因 联 合起 来 以 提 高 疗 效 。 新 城 疫 病 毒 的HN 蛋 白 具 有 神 经 氨 酸 酶 活 性 能 水解 宿 主 细 胞 表 面 唾 液 酸 ， 暴 露 宿 主细 胞 生 物 识 别 位 点 并 上 调 MHCI 分 子 的 表 达 ， 且 HN蛋 白 定 位 于 肿 瘤 细 胞 膜 上 形 成 自 身 特 殊 的 识 别 部 位从 而 提 高 了 机 体 免 疫 系 统 对 肿 瘤 细 胞 的 识 别 杀伤 1。 来 源 于 禽 白 血 病 病 毒 的 凋 亡 素 基 因 能 够 诱 导人 肿 瘤

7、细 胞 凋 亡 且 不 依 赖 肿 瘤 细 胞 内 p53 和 bcI-2表 达 状 态 2， 对 p53 突 变 和 bcI-2 高 表 达 的 肿 瘤 细 胞同 样 具 有 杀 伤 作 用 ， 但 对 于 正 常 细 胞 却 无 诱 导 凋 亡的 作 用 。 白 介 素 18 作 为 IFN-Y诱 生 剂 ， 通 过 作 用 于NK 细 胞 而 发 挥 抗 肿 瘤 作 用 3。 本 研 究 构 建 了 真 核表 达 质 粒 pIRVP3IL-18HN， 探 索 了 凋 亡 素 基 因 ， 新 城疫 病 毒 的 HN 和 IL-18 基 因 的 联 合 抗 肿 瘤 作 用 。1 材 料 与

8、方 法1.1 质 粒 、 菌 种 、 细 胞 与 毒 株双 启 动 子 真 核 表 达 载 体 pIRES 和 重 组 表 达 质 粒pVHN， pVIL-18， pIRVP3， pVIL-18HN 由 本 室 鉴 定 保存 。 E.coIi DH5a由 本 室 保 存 。 B16 细 胞 购 自 中 科 院上 海 细 胞 所 。 NDV 长 春 株 由 本 室 保 存 。1.2 工 具 酶 与 试 剂DNA 限 制 性 内 切 酶 及 T4 DNA 连 接 酶 均 购 自33李 霄 等 ： 联 合 应 用 凋 亡 素 基 因 、 新 城 疫 病 毒 HN 基 因 及 IL-18 基 因 对

9、黑 色 素 瘤 的 抑 制 效 应 研 究t联 系 人 。（ 收 稿 日 期 ： 2004-02-26）男 ， 1979 年 生 ， 硕 士 生 ； 研 究 方 向 ： 分 子 病 毒 学 。973 规 划 （ 3199011902） ； 自 然 科 学 基 金 （ 39893290-4-3） 资 助 项 目 。TakaRa 公 司 。 鼠 抗 人 IL-1S 单 克 隆 抗 体 购 自 MBL公 司 。 碱 性 磷 酸 酶 （ AP） 标 记 兔 抗 鼠 IgG 购 自Promega 公 司 。 抗 NDV 阳 性 血 清 购 自 中 国 兽 药 监 察所 。 脂 质 体 DOSPER 购

10、自 Roche 公 司 。 TRIZOL!Reagent 购 自 GIBCO 公 司 。 Tag DNA 聚 合 酶 购 自TakaRa 公 司 。 RT-PCR 试 剂 盒 购 自 Amersherm 公 司 。硝 酸 纤 维 素 膜 为 Whatman 公 司 产 品 。 NBT、 BCIP 购自 上 海 Sangon 公 司 。 PCR 引 物 由 大 连 宝 生 物 公 司合 成 。 丙 烯 酰 胺 ， 双 丙 烯 酰 胺 ，!-巯 基 乙 醇 ， TEMED，过 硫 酸 胺 等 购 自 GIBCO 公 司 。1.3 实 验 动 物4 6 周 龄 雄 性 C57BL 小 鼠 ， 购 自

11、 中 国 医 科 大 学实 验 动 物 中 心 。1.4 重 组 表 达 质 粒 的 构 建将 质 粒 pVIL-1SHN 用 限 制 性 内 切 酶 Sma和Xba双 酶 切 后 ， 回 收 IL-1SHN 片 断 ， 与 用 限 制 性 内切 酶 Sma和 Xba双 酶 切 的 pIRVP3 表 达 载 体 质 粒相 连 接 ， 构 建 重 组 表 达 质 粒 pIRVP3HNIL1S。 质 粒 的酶 切 、 连 接 及 转 化 按 分 子 克 隆 介 绍 的 常 规 方 法 进行 4。1.5 Western blot 检 测采 用 脂 质 体 介 导 法 将 构 建 的 重 组 质 粒p

12、IRVP3HNIL1S 体 外 转 染 B16 细 胞 ， 72 h 后 收 集 细胞 ， 提 取 蛋 白 ， 经 SDS-PAGE 分 离 后 ， 电 转 移 至 硝 酸纤 维 素 膜 ， 并 分 别 依 次 与 鼠 抗 人 IL-1S 单 克 隆 抗 体和 AP 标 记 的 兔 抗 鼠 IgG， 鼠 抗 NDV 阳 性 血 清 和 AP标 记 的 兔 抗 鼠 IgG 反 应 ， 最 后 置 含 NBT 和 BCIP 的 碱性 磷 酸 酶 缓 冲 液 中 显 色 10 20 分 钟 ， 观 察 是 否 有 特异 条 带 。 同 时 设 空 载 体 质 粒 对 照 。1.6 RT-PCR 检

13、测脂 质 体 体 外 转 染 B16 细 胞 ， 72h 后 收 集 细 胞 ， 应用 TRIZOL!Reagent 细 胞 裂 解 液 按 传 统 方 法 提 取 总RNA。 按 Ready- To- Go 试 剂 盒 说 明 书 进 行 反 转 录 。配 制 包 括 10 X PCR buffer、 Tag DNA 聚 合 酶 、 上 下 游引 物 、 去 离 子 水 和 RT 产 物 的 PCR 反 应 液 ， 按 95C 5分 钟 ， 94C 30 秒 ， 55C 30 秒 ， 72C 1 分 钟 ， 72C 10分 钟 ， 共 30 个 循 环 ， 进 行 PCR。 PCR 产 物

14、于 1%的 琼脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 鉴 定 ， 以 核 苷 酸 分 子 量 Marker（ DL2000） 确 定 目 的 条 带 大 小 。1.7 C57BL/6 小 鼠 荷 黑 色 素 瘤 模 型 的 建 立 及 治 疗C57BL/6 小 鼠 共 50 只 构 建 荷 瘤 模 型 。 方 法 ： 胰酶 消 化 指 数 生 长 期 的 B16 细 胞 ， 调 整 其 浓 度 为 2 X106 个 /ml， 每 只 小 鼠 左 后 肢 皮 下 注 射 0.1ml（ 2 X 105个 /只 ） 。 S 10 天 后 小 鼠 长 出 米 粒 大 小 的 瘤 块 ， 表明 荷 瘤 成 功

15、。 取 40 只 成 功 荷 瘤 的 C57BL/6 小 鼠 随机 分 成 5 组 ， 每 组 S 只 。 每 只 小 鼠 进 行 股 四 头 肌 注射 质 粒 （ 重 组 质 粒 1脂 质 体 = 1011） 100#g， 对 照 组 注射 100#l Hanks 液 。 注 射 方 法 是 ： 每 7 天 注 射 1 次 ，共 注 射 3 次 ， 末 次 注 射 后 10 天 处 死 小 鼠 。1.8 肿 瘤 生 长 率 和 抑 瘤 率 测 定自 注 射 之 日 起 ， 每 隔 4 天 测 定 荷 瘤 小 鼠 肿 瘤 三个 互 相 垂 直 直 径 ， 计 算 肿 瘤 体 积 并 绘 制 肿

16、 瘤 生 长 率曲 线 。 处 死 小 鼠 后 称 量 瘤 重 并 计 算 抑 瘤 率 （ 计 算 公式 如 下 ） 。抑 瘤 率 =对 照 组 平 均 瘤 重 - 免 疫 组 平 均 瘤 重对 照 组 平 均 瘤 重2 结 果2.1 重 组 质 粒 pIRVP3IL-18HN 的 酶 切 鉴 定pIRVP3IL-1SHN 重 组 质 粒 用 EcoRI 酶 切 鉴 定 可见 363bp 片 断 ， 表 明 VP3 基 因 已 正 确 插 入 载 体 质 粒 ；用 SmaI 与 XbaI 双 酶 切 鉴 定 可 见 2.4kb 片 断 ， 表 明IL-1SHN 融 合 基 因 已 正 确 插

17、入 载 体 质 粒 中 。2.2 IL-18和 HN基 因 体 外 表 达 的 Western blot 检 测图 1 所 示 ， Western blot 检 测 可 见 SSkD 的 特 异条 带 ， 表 明 用 抗 IL-1S 单 克 隆 抗 体 和 标 准 HN 阳 性 血清 均 可 以 检 测 到 IL-1SHN 融 合 蛋 白 的 表 达 。1.4.质 粒 载 体 对 照 ； 2.IL-1S 单 克 隆 抗 体 检 测 IL-1SHN 融 合 蛋 白 表 达 ；3.标 准 HN 阳 性 血 清 检 测 IL-1SHN 融 合 蛋 白 表 达图 1 重 组 质 粒 PIRVP3IL-

18、18HN Western blot 检 测43高 技 术 通 讯 2004.122.3 重 组 质 粒 体 外 表 达 RT-PCR 鉴 定图 2 所 示 ， 重 组 质 粒 体 外 转 染 细 胞 提 取 的 总RNA（ DnaseI 处 理 30min） ， 经 RT-PCR 后 电 泳 ， 可 见363bp 的 片 断 ， 表 明 重 组 质 粒 中 的 凋 亡 素 基 因 可 在鸡 胚 成 纤 维 细 胞 中 有 效 表 达 。1.DNA Marker； 2.RT-PCR 扩 增 产 物 ；3.质 粒 载 体 对 照 ； 4.鸡 胚 成 纤 维 细 胞 对 照图 2 重 组 质 粒 R

19、T-PCR 鉴 定 图 谱2.4 抑 瘤 率对 肿 瘤 生 长 趋 势 及 抑 瘤 率 的 分 析 显 示 ， VP3、IL-18 和 HN 基 因 均 有 抑 瘤 作 用 ， 其 中 pIRVP3IL-18HN 重 组 质 粒 对 肿 瘤 的 抑 制 效 果 最 好 ， 其 抑 瘤 率 为28%， 在 所 有 实 验 组 中 最 高 ， 而 其 肿 瘤 生 长 率 最 低 。图 3 肿 瘤 生 长 趋 势 图图 4 各 实 验 组 抑 瘤 率3 讨 论肿 瘤 的 发 生 与 发 展 是 一 个 多 因 素 、 多 阶 段 、 多 基因 的 复 杂 变 化 过 程 。 传 统 的 肿 瘤 手

20、术 治 疗 只 能 去 除原 发 病 灶 ， 不 能 从 根 本 上 杜 绝 其 再 生 与 繁 殖 ； 放 化 疗虽 能 杀 灭 肿 瘤 细 胞 ， 但 也 使 大 量 正 常 组 织 细 胞 受 到严 重 损 伤 。 随 着 核 酸 疫 苗 的 发 展 ， 特 别 是 治 疗 性 疫苗 的 研 制 ， 为 控 制 肿 瘤 提 供 了 新 的 思 路 。 研 究 表 明 ，肿 瘤 细 胞 表 面 的 唾 液 酸 含 量 明 显 高 于 正 常 细 胞 ， 可以 通 过 其 高 度 唾 液 化 的 表 面 有 效 抵 制 免 疫 防 御 5，从 而 使 肿 瘤 细 胞 扩 散 。 HN 蛋 白

21、 具 有 类 似 于 流 感 病毒 的 神 经 氨 酸 酶 （ NA） 活 性 ， 可 以 水 解 细 胞 表 面 唾 液酸 ， 使 肿 瘤 细 胞 表 面 抗 原 充 分 暴 露 ， 增 强 肿 瘤 细 胞 的免 疫 原 性 ， 增 强 免 疫 监 视 细 胞 的 识 别 和 杀 伤 1。 同时 ， HN 还 可 以 诱 发 IFN， 并 通 过 上 调 效 应 细 胞 的 凋亡 配 基 ， 促 进 肿 瘤 细 胞 的 凋 亡 6。 细 胞 凋 亡 是 机 体清 除 多 余 、 变 异 或 恶 性 变 细 胞 的 一 种 主 动 、 程 序 化 生理 过 程 。 许 多 刺 激 因 子 诱

22、导 细 胞 凋 亡 依 赖 肿 瘤 抑 制因 子 p53 途 径 。 Akinori Takaoka 等 7研 究 发 现 IFN能 诱 导 产 生 浓 度 适 中 的 p53 蛋 白 ， 在 抑 制 肿 瘤 的 同时 降 低 其 对 细 胞 的 副 作 用 。 但 肿 瘤 在 其 发 展 中 会 发生 p53 突 变 ， 从 而 影 响 治 疗 效 果 。 鸡 贫 血 病 毒 的 凋亡 素 基 因 被 认 为 具 有 以 非 p53 依 赖 性 途 径 诱 导 人 肿瘤 细 胞 或 转 化 细 胞 ， 而 非 正 常 细 胞 凋 亡 的 作 用 8， 且不 受 BOI-2 的 抑 制 ， 是

23、 一 种 潜 在 的 抗 肿 瘤 生 物 制 剂 。近 年 来 随 着 细 胞 因 子 研 究 的 进 展 ， 发 现 许 多 细 胞 因子 能 明 显 增 强 特 异 性 抗 原 的 免 疫 原 性 或 增 强 机 体 对抗 原 的 反 应 性 。 这 些 细 胞 因 子 一 方 面 调 节 机 体 的 特异 性 免 疫 反 应 ， 一 方 面 增 强 机 体 的 非 特 异 性 免 疫 反应 ， 并 诱 导 机 体 产 生 有 效 的 免 疫 保 护 力 ， 尤 其 是 对 免疫 力 低 下 个 体 具 有 十 分 重 要 的 意 义 。 IL-18 具 有 增强 NK 和 CTL 细 胞

24、 活 性 、 促 进 T 细 胞 增 殖 活 化 、 增 强Fas 介 导 的 细 胞 毒 作 用 等 多 种 生 物 学 功 能 ， 另 外 它还 具 有 强 烈 的 IFN-!诱 生 能 力 9， 是 一 种 应 用 前 景较 好 的 抗 肿 瘤 细 胞 因 子 。 本 研 究 构 建 了 表 达 融 合IL-18HN 和 VP3IL-18 的 真 核 表 达 质 粒 ， 将 该 重 组 质粒 与 单 独 表 达 IL-18HN 和 凋 亡 素 基 因 的 重 组 质 粒 分别 注 射 荷 B16 肿 瘤 的 C57BL/6 小 鼠 ， 通 过 比 较 抑 瘤率 ， 探 讨 了 HN、 凋

25、 亡 素 和 IL-18 基 因 的 协 同 抑 瘤 效果 。 结 果 显 示 ， pIRVP3IL-18HN 重 组 质 粒 的 抑 瘤 效果 明 显 高 于 上 述 基 因 的 单 独 应 用 ， 说 明 凋 亡 素 基 因与 IL-18 和 HN 有 协 同 抑 瘤 效 应 ， 联 合 基 因 治 疗 可 显著 提 高 抑 瘤 效 果 ， 但 对 其 确 切 机 制 尚 需 进 一 步 研 究 。53李 霄 等 ： 联 合 应 用 凋 亡 素 基 因 、 新 城 疫 病 毒 HN 基 因 及 IL-18 基 因 对 黑 色 素 瘤 的 抑 制 效 应 研 究参 考 文 献 1 Zeng

26、J， Fournier P， Schirrmacher V. StimuIation of humannaturaI interferon-aIpha response via paramyxovirus hemaggIu-tinin Iectin-ceII interaction. Mol Med， 2002， 80（ 7） ： 443 2 Pietersen A M， Rutjes S A， Van Tongeren J， et aI.The tumor-seIective viraI protein apoptin effectiveIy kiIIs human biIiarytract

27、 cancer ceIIs. Mol Med， 2003， 28 3 Xia D， Zheng S， Zhang W， et aI.Effective induction of thera-peutic antitumor immunity by dendritic ceIIs coexpressing inter-Ieukin-18 and tumor antigen. Mol Med， 2003， 81（ 9） ： 585 4 Sambrook J， Fritsch EF， Maniatis T 著 . 金 冬 雁 ， 黎 孟 枫 译 .分 子 克 隆 实 验 指 南 . 第 2 版 ，

28、北 京 ： 科 学 出 版 社 ， 1992.16 5 Schirrmacher V， AhIert T， ProbstIe T et aI. Immunization withvirus-modified tumor ceIIs. Semin Oncol， 1998， 25（ 6） ： 177 6 Zeng J， Fournier P， Schirrmacher V. Induction of interferon-aIpha and tumor necrosis factor-reIated apoptosis-inducingIigand in human bIood mononucIe

29、ar ceIIs by hemaggIutinin-neuraminidase but not F protein of NewcastIe disease virus.Vi-rology， 2002， 297（ 1） ： 19 7 Takaoka A， Hayakawa S， Yanai H， et aI. Integration of inter-feron-!/signaIing to p53 responses in tumour suppression andantiviraI defence. Nature， 2003， 424： 516 8 Pietersen A， Notebo

30、rn H M， Apoptin. Med Biol， 2000， 465 9 SegeI M J， Izbicki G， Cohen P Y， et aI. RoIe of interferon-gamma in the evoIution of murine bIeomycin Iung fibrosis.Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2003， 285（ 6） ： L1255Construction of Nucleic Vaccine Expressing Apoptin gene，NewcastleDisease Virus HN Gene and IL

31、-18 gene and its antitumor effect on B16Li Xiao， Jin Ningyi， Mi Zhigiang， Lian Hai， Sun Yingchun， Li Jie!， Guan Guofang!（ Key Genetic Engineering Lab， Academy of MiIitary MedicaI Science， PLA， Changchun， JiIin 130062）（!HematoIogy Tumor Department， The First HospitaI of JiLin University， Changchun， J

32、iIin 130021）（!OtorhinoIaryngoIogy， The Second HospitaI of JiLin University， Changchun， JiIin 130041）AbstractIn past studies， the apoptin gene from Chicken anemia virus， IL-18 gene and the HN gene from NewcastIe diseasevirus were found to have the antitumor efficacy， but their antitumor mechamisms ar

33、e different. In order to observe thecombinative antitumor effect of the above three genes， eukaryotic expression pIasmid pIRVP3IL-18HN was constructed byinserting apoptin gene into the downstream of CMV promotor and the fused IL-18HN gene into the downstream of IRESpromotor in the doubIe promotor ve

34、ctor pIRES.The B16 meIanoma modeI in C57BL/6 was constructed and the mice wereinjected introtumorIy with pIRVP3IL-18HN mixed with Iiposome for 3 times， and each with 100#g recombinant pIasmid.The rate of tumor suppression after 3 times of injection was measured. The resuIts demonstrated that the tum

35、or suppres-sion rate of pIRVP3IL-18HN was higher than those of pVIL-18HN， pVIL-18， pVIL-18VP3 and Hanks controI group.These data suggests that the combinative appIication of HN， VP3 and IL-18 resuIt in a coordinated tumor suppression effi-cacy.Key words： Apoptin gene， NewcastIe Disease Virus HN gene， IL-18 gene， Combinative antitumor effect63高 技 术 通 讯 2004.12