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1、/PCR实验室作业指导书 文件编号:第2版编制: 审核: 批准: 生效日期:2012年 月 日/目 录序号主 题 内 容 代 号页 号1PCR实验室的设置及管理2PCR实验室工作制度3实验室内务管理及清洁制度4PCR实验室人员的配置及管理5实验人员的培训程序6PCR实验室清洁程序7样品编号的标准操作程序8PCR基因扩增实验室的要求9PCR废弃物的处理程序10试剂准备区工作制度、标准操作、程序文件11标本制备区工作制度、标准操作、程序文件12扩增区工作制度、标准操作、程序文件13产物分析区工作制度、标准操作、程序文件14PCR标本的保存操作程序15PCR标本的采集、运送、接收程序16PCR生物安
2、全防护措施17PCR实验室化学试剂配18PCR实验室记录管理制度19PCR应急处理程序20PCR试剂的质检标准操作程序21PCR消耗品进购质检贮存程序22PCR室内质量控制操作程序23PCR室间质量控制操作程序24PCR温度校准标准操作程序25伯乐PTC-200型核酸扩增仪操作规程26ABI 7300型荧光定量扩增仪操作维护规程27DYY-6C电泳仪操作维护规程28Bio-Rad GelDoc_XR凝胶成像仪使用说明书29恒温水浴箱操作维护规程30旋涡振荡器操作维护规程31普通离心机操作维护规程32高速离心机操作维护规程33低温高速离心机操作维护规程34冰箱操作维护规程35超低温冰箱操作维护规
3、程36生物安全柜操作维护规程37超净工作台操作维护规程38移液器操作维护规程/ 修 订 页序号文件编号页码需更改的内容更改内容批准人批准日期1234567891011121314151617181920/PCR实验室的设置及管理1目的:建立实验室的合理设置和科学管理,防止实验污染,保证检测结果的可靠性。2适用范围:本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。3负责人: 4细则:41 分子诊断室为检验科下设的专业实验室,从事基因扩增检测及相关实验工作。42 本实验室采用普通RT-PCR扩增和实时荧光定量PCR两种技术作为临床基因诊断的主要手段,实验室分为四个区:试剂准备区(第一区)、标本
4、处理区(第二区)、扩增区(第三区)及产物分析区(第四区)。每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服,并有明显的区分标识。各区标签颜色:红色(第一区)、白色或绿色(第二区)、蓝色(第三区);专用工作服:粉红色(第一区)、白色(第二区)、蓝色(第三区)。标本的接收则在检验科标本接收处进行。43 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等,不可混用。44 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。45 严格遵守从“试剂准备区标本处理区扩增区产物分析区”的单一流向制度,不得逆向进入前一工作区。46 非本实验室工作人员,未经许可不得入内;进
5、修、实习或其他科室人员因需要,进入实验区域(试剂准备区、标本处理区、扩增区、产物分析区) 需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行,在本实验室人员监督指导下进行。47 实验完毕后做好清洁消毒工作。5. 本文涉及以下图表:1.实验室设计平面图/PCR实验室工作制度1目的 :保持良好的工作环境,以确保检测结果的可靠性,防止交叉污染,防止差错、事故及纠纷的发生。2适用范围:所有本实验室人员。3负责人: 4细则:41 本实验室用于基因扩增检测及相关实验工作,不得进行其它实验操作。42各区的用品不得混用。43在各区的实验操作过程中,操作者必须戴手套和帽子,严格按照操作规程。44试剂准备区只能进行试剂的贮
6、存及配制等相关操作(见相关SOP文件)。45标本处理区只能进行临床标本的保存,核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成(见相关SOP文件)。46扩增区只能进行DNA或cDNA的扩增、实时荧光PCR扩增产物的分析(见相关SOP文件)。47产物分析区只能进行RT-PCR扩增产物的分析(见相关SOP文件)。4. 8进行实验时严格执行本实验室的各项操作规程,及时做好各种操作记录,力求准确、可靠。实验完毕,做好清洁、整理及分析统计等工作。49室内仪器由专人负责,未经许可,不得随意使用或挪用;爱护使用仪器,定期进行保养与维修。4. 10 爱护医院财产,注意安全;离开实验室前应关好门窗
7、,检查水、电等。/PCR实验室内务管理及清洁制度1目的:保证实验室日常内务管理及清洁工作顺利进行。2适用范围:实验室相关人员及相关清洁工人。3负责人: 4细则:41内务管理制度a. 非本室工作人员未经允许不得进入实验室。b. 各区的用品不得混用。c. 实验人员要有强烈的时间观念,按时上下班,不迟到、早退。d. 进入实验室的工作人员必须遵守实验室的单一流向的规定,禁止逆向走动。e. 所有仪器(如PCR扩增仪)须有专人负责,并有使用维护记录;实验人员必须熟悉仪器性能后方允许操作,并严格遵守操作规程。f. 所有试剂进购、配制、质检、使用均要有记录,未经允许不得随意带出本实验室。g. 各区的各种清洁消
8、毒均应有记录,工作衣消毒时注意各区应分开进行处理。h. 注意保持实验室卫生整洁,严禁在室内抽烟、吃零食,非实验操作人员应尽量少入。i. 每天了解仪器运转情况及试剂使用情况,负责仪器的整洁,安全;下班前检查门、窗、水、电,节假日指定人员负责检查实验室的仪器、设备,确保安全。4.2 内务清洁制度a. 实验室地面保持平整、干净,通道要利于通行,没有无用的物品阻碍。 b. 合理规划实验室内物品,做到摆放整齐、有序,无用的或使用效率低的物品放置到储存处,常用的物品要容易寻找到。c. 抽屉、柜子、文件类物品要作好标记,以方便识别。d. 实验结束后用75%酒精对台面进行清洁,并经紫外灯进行消毒。e. 每天实
9、验结束后,紫外灯消毒60分钟后,依次关闭各区紫外灯并记录照射时间f. 搞卫生时,依次清洁四个区的实验台面和地面,各区清洁消毒工具均专用,不可混用,注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。g. 处理好各区废弃物,高压消毒后集中处理。h. 每周将工作服交消毒洗涤,不同实验区的工作服分开洗 /PCR实验室人员的配置及管理1目的:保证实验室有足够数量的合格的具备开展该类实验能力的实验人员。2适用范围:适用于实验室人员配置、管理、培训及考核。3负责人: 4细则:41 人员要求a. 鉴于PCR技术要求的特殊性、复杂性,本实验室工人员应为有经验的医学检验专业人员。b. 实验室工作人员应参加上级举办的PCR技术
10、培训,并取得合格证。c. 对于新进入本室的人员,如尚未取得PCR技术培训合格证,应在实验室有培训合格证的上级技术人员的指导下进行实验工作,实验报告由有资格人员出具,并应在最短的时间内取得上岗培训合格证。d. 实验室工作人员上岗前必须学习并掌握PCR实验室管理文件。42 人员配置a. 实验室应根据工作需要配备足够的工作人员,目前实验室有主管技师2人、技师?人,?人都已获得培训合格证,视工作量的增加和业务发展需要,会适当增加工作人员。b. 由实验室负责人负责全面管理、技术指导、解决与临床沟通及技术疑难问题;其他各级技术人员履行相应的工作职责。43 人员管理实验室建立所有工作人员的技术档案,包括:学
11、历、任职资格、发表论文、研究成果、培训等相关材料复印件。技术档案分文本档案和电子档案,文本档案每年更新1次,电子档案随时更新。5. 本文涉及以下图表:实验室主要负责人简历表 PCR实验室工作人员一览表 人员档案卡 实验室人员的培训程序1.目的: 保证实验室有足够的技术力量和科室适应长远发展的需要。2.适用范围: 核酸扩增荧光检测实验室实验人员及预备培训的人员。3.负责人: 4.细则:4. 1实验室负责人或负责人指定人员参加每年省CDC的室间质评总结会。4. 2实验室工作人员每12年至少参加1次PCR技术的省级或国家级继续教育项目,参加相关学术交流会议。4. 3安排未取得上岗培训合格证的工作人员
12、在合适的时间内参加技术培训。4. 4科室不定期组织实验室内部实验人员学习、更新核酸扩增方面的相关知识,提升自身的理论学习水平。特别是在标本接收区采血、接收标本的人员,需定期对其进行有关核酸扩增技术,标本采集、保存、运输等知识的培训。4. 5本实验室工作人员每年进行考核一次,考核内容:a)日常工作质量b)室内质控测评c)室间质控测评d)在抱怨处理中的表现4. 6本实验室工作人员均建立业绩档案,实行能进能出制度,不断吸收高质量人员,加强培训和提高, 对于不适合本室工作的人员要及时调离。5. 本文涉及以下表格 培训申请表 年度培训计划表 培训记录表 员工培训履历表 /PCR实验室清洁程序1目的:保证
13、实验室环境的整洁,防止污染。2适用范围:适于实验室工作环境、实验台面、工作服、移液器等的清洁消毒工作。3负责人: 操作人: 4细则:41 实验室地面必须平整、干净,通道要利于通行,没有无用的物品阻碍。42 合理规划实验室内物品,做到摆放整齐、有序,无用的或使用效率低的物品放置到储存处,常用的物品要容易寻找到。43 抽屉、柜子、文件类物品要作好标记,以方便识别。44 实验结束后用75%酒精对台面进行清洁,并用紫外灯进行消毒。45 每天对使用过的移液器用75%酒精进行擦拭。 46 实验过程中如发生标本或试剂外溅,应立即用75%酒精滴上,滤纸盖上半小时,然后用酒精擦洗,并用移动紫外灯消毒。 47 每
14、天实验前开启各区的通风系统,各区实验结束后,分别打开传递窗紫外灯、天花板紫外灯消毒实验室,每次开启 3060分钟。 48 待紫外灯消毒时间足够后,依次关闭各区紫外灯并记录。 49 依次清洁四个区的实验台面和地面,各区清洁消毒工具均专用,不可混用,注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。 410 处理好各区废弃物,交医院集中处理。 411 每周将工作服交院洗衣房洗涤消毒,不同实验区的工作服隔开洗涤。5. 本文涉及以下表格实验室清洁消毒记录表 垃 圾 处 理 记 录 表 /PCR样品编号的标准操作程序1目的:保证标本编号的唯一性,也是准确发放报告的基础。2适用范围:使用核酸扩增荧光检测实验室所开展的
15、几?种检测项目:流感病毒、手足口病毒、霍乱弧菌等。3负责人: 操作人: 4细则:41 按检测类型分类标记根据检测项目的不同,每种检测项目对应标记一种唯一的代号。如流感病毒标记为 ?,手足口病毒标记为?。42 按标本接收顺序编号在同种检测类型的标本中,按标本检测顺序编号。如第一个检测流感病毒的标本编为?001,第二个检测流感病毒的标本编为?002,第三个检测结核的验单编为?003等。43 编号步骤a. 对接受的标本,根据编号的基本原则编号,每个样本对应一个唯一的编号(如?)。b. 在样品送检单和对应的样品管上作好相同的标记。c. 做好标本的接收记录,每个样本的记录都应包括以下信息:接收时间、送检
16、单位、患者姓名、性别、年龄、标本类别、标本状态、送标本者、接收人、标本编号等。d. 处理好样品、点样后,将反应管放入扩增仪上开始扩增。e. 扩增得到结果后,先在登记表上填入结果,作好记录,再一一把实验结果填入相应报告单。f. 发放检验报告单。5. 本文涉及以下图表:PCR标本接收记录表 PCR结果登记表表/PCR基因扩增实验室的要求1目的:规定在各区内所进行的工作及其操作。2适用范围:所有在本区内进行的工作。3负责人: 操作人: 4程序:实验室分四?区:试剂贮存、准备区;标本制备区;扩增区;产物分析区。进入各区严格按照单一方向进行,即试剂贮存、准备区标本制备区扩增区产物分析区。各区及其设备、物
17、品必须有明确的标记,严禁混用。进入PCR实验室的工作人员(含卫生员),都必须遵守实验室的规则,尤其严格遵守进入PCR实验室的唯一流向。不可进入PCR扩增后区打扫卫生,再返回扩增前区工作。防止非本室工作人员串岗,进入本室。尤其不得为找人,而逆向误入PCR实验室。总则(1) PCR实验室工作人员应具备医学检验、微生物检验基本知识,并受过PCR实验的基础知识和技能培训。(2) PCR实验室分试剂准备,样本准备,PCR扩增和产物分析四个室,各室的实验物品(含加样器,试管架,吸头,记录纸,笔等),不得混用,须贴上标签予以区别。(3) 实验室技术人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行,包括实验室擦洗。台
18、面消毒,离心管,吸头的无菌灭活准备,仪器使用和废弃物处理等。(4) 进入实验室的工作人员必须更换各室不同的工作服(含帽和鞋),勤换洗工作服,以及遵守实验室的唯一流向的规定,严禁反向流动。(5) 进入PCR实验室后区的物品不许带进PCR实验室前区。每天实验开始前,必须清洁地面和消毒实验室前区。实验结束应紫外线消毒实验台面。每天下班前处理好废物,应关好水、电、煤气和门窗。(6) 定期校准和维修PCR仪、酶标仪及离心机、水浴箱等仪器设备。(7) 实验室内不得饮食、吸烟。4.1标本接收区a. 实验人员进入该区须穿本区白色工作服,接收标本须戴一次性手套。b. 记录实验室干、湿度,登记冰箱温度。使用带有本
19、区标识的记录本、纸和笔,每项记录,书写工整详细。c. 对送检的标本实行双签制度,并仔细检查是否符合检测要求,对有不符合要求的标本及时通知相关科室重新采样,并作记录,每份标本需给出唯一性编号。d. 本区所有废弃物分类装入垃圾袋,封好,在垃圾筐上套好新的垃圾袋,将垃圾带出实验室。e. 每次实验结束后,清洁实验台及地面打开紫外灯消毒30分钟。记录紫外灯使用情况。4.2试剂贮存、准备区a. 使用带有本区标识的记录本、纸和笔,每项记录,书写工整详细。b. 准备好的试剂送入下一区 ,还原实验台面,将本区所有废弃物分类装入垃圾袋,封口,在垃圾筐上套好新的垃圾袋,将本区垃圾带出实验室。c. 白色工作服留在本区
20、。d. 本区维持相对正压状态(开启缓冲区的排气扇)。实验结束后,清洁实验台及地面打开紫外灯消毒30分钟。4.3标本制备区a. 实验人员进入该区须在缓冲区更换专用蓝色工作服及拖鞋。实验中须使用一次性帽子,戴手套,手套在实验过程中疑有污染应立即更换。b. 将传入本区的试剂放入冰箱冷冻室试剂存放专区暂存。记录实验室干、湿度,登记冰箱温度。c. 将检测完的标本密封保存在毒种间-70冰箱中,然后记录标本的保存情况。d. 使用带有本区标识的记录本、纸和笔,每项记录,书写工整详细。e. 按试剂盒说明书对标本进行处理,将处理好的标本在生物安全柜内加样,记录标本的处理过程。f. 将加样后的试剂传送下一区,还原实
21、验台面,关闭所有仪器,记录仪器使用时间和运行状态。g. 使用过的离心管、吸头实验结束后须高压消毒后方丢入垃圾袋,所有样品应按有生物传染性危险品对待。h. 将本区所有废弃物分类装入垃圾袋,封口,在垃圾筐上套好新的垃圾袋,将垃圾带出本区。i. 将蓝色工作服留在本区。j. 本区应避免不必要的走动,同时维持相对正压状态,实验结束后,清洁安全柜、实验台及地面,打开紫外灯消毒30分钟。4.4扩增区a. 实验人员进入该区须在缓冲区更换专用?色工作服及拖鞋。b. 记录实验室干、湿度,登记冰箱温度。c. 使用带有本区标识的记录本、纸和笔,每项记录,书写工整详细。d. 将传入本区加样后的试剂上机扩增。e. RT-
22、PCR扩增完成后,将样品通过传递窗传入下一区;实时荧光PCR扩增完成后,记录检测结果,及时发放报告单;记录仪器使用时间和运行状态。f. 将本区所有废弃物分类装入垃圾袋,封口,在垃圾筐上套好新的垃圾袋,然后将垃圾带出实验室。g. 将粉色工作服留在本室再离开实验室。4. 5产物分析区a. 将传入本区加样后的试剂上机扩增b. 扩增完成后,记录检测结果,及时发放报告单,记录仪器使用时间和运行状态。c. 将本区所有废弃物分类装入垃圾袋,封口,在垃圾筐上套好新的垃圾袋,然后将垃带出实验室。d. ?工作服留在本室再离开实验室e. 严禁本区物品带至其他区,实验结束后清洁该区打开紫外灯照射,最好整夜消毒,记录紫
23、外灯使用情况。5. 本文涉及以下表格PCR实验室环境温湿度记录表 冰箱温度登记表 实验室清洁消毒记录表 垃 圾 处 理 记 录 表 紫外消毒车消毒记录表 /PCR废弃物的处理程序1目的:保证实验室、实验人员和外部环境的安全。2适用范围:核酸扩增检测实验室常用化学试剂(NaOH、EDTA、乙醇、生理盐水等)、实验室废弃物的处理;3负责人: 操作人: 4细则:4.1科室职责应对本室工作人员讲明本程序在预防交叉、实验室污染及切断传播途径中的重要性,并要求严格执行。4.2实验室所有垃圾,装入专用污物袋内,各区备有:生活垃圾袋(黑色)及生物污染垃圾袋(黄色)。使用过的一次性消耗品(如试管、吸头、离心管、
24、等)在实验结束后立即高压消毒,再放入黄色垃圾袋内,使用过的手套、鞋套等直接放入黄色垃圾袋内再集中处理。4.3 夹取标本的工具,如钳、镊、吸管等,用后均应消毒清洁,进行微生物检验时,应重新灭菌,金属工具可烧灼灭菌或消毒液浸泡;玻璃制品高压蒸汽灭菌。4.6 盛标本的容器,若为一次性使用的纸质容器及其外面包被的废纸,用高压蒸汽灭菌后集中处理;对可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器,煮沸15分钟或加入10%次氯酸钠溶液浸泡24小时,消毒液每日更换,消毒后用洗涤剂及流水刷洗,沥干,用压力蒸汽灭菌后备用。4.7 废弃标本及其容器装入黄色垃圾袋内,高压蒸汽灭菌后,交污物处理中心集中处理。4.8日常生活垃圾如纸屑
25、等按一般垃圾处理。5. 本文涉及以下表格 PCR废弃标本处理交接表 /试剂准备区工作制度 标准操作、程序文件1目的:规范试剂准备区的配置、功能、内务管理等。2适用范围:PCR实验室。3负责人: 操作人: 4细则:4.1 配置: 普通冰箱?一台,超净工作台一台,台式离心机一台,混匀器一台,加样器一套,可移动紫外灯?一台,空调一台,生物垃圾桶和生活垃圾桶各一个,办公用品若干。4.2 功能: 储存溶液的准备,反应体系的准备,分装,成品试剂和化学试剂的贮存,75%乙醇,?病毒培养液等简单试剂的配制。4.3 内务管理:f. 着装和标识:本区工作服以白色?、专用设备以绿色?为标识。g. 实验人员进入该区须
26、穿本区专用白色工作服。实验中须戴一次性手套、鞋套或本区专用拖鞋。h. 记录温湿度计读数和冰箱的温度计读数。(本区每天在工作前利用本区的温控设备使温度控制在15-25之间)i. 根据当天的标本取出当天实验须配制和使用的试剂,其余试剂要立即收好放回冰箱内。试剂的配制须在超净工作台内完成。 j. 每次实验均应清点库存试剂,每周检查有无过期或将近到期的试剂,或作报废处理或优先使用,避免浪费,然后记录试剂的详细保存情况。k. 实验中使用的离心管、吸头等均为一次性用品,使用时应在消毒有效期内。l. 试剂准备工作完成后,将使用过的离心管、吸头置于盛有84消毒液的废液缸中,还原实验台面。m. 将准备好的试剂放
27、入传递窗中。其他区的用品不得带入本区。每次实验记录,书写工整详细,应使用本室专用的、带本室标识的记录本、纸和笔。n. 走出试剂准备室,在缓冲区脱下工作服,将手套及鞋套置于专用污物桶中。o. 工作完毕打开紫外灯消毒30分钟。 5. 本文涉及以下表格试剂保存使用登记表耗材使用登记表实验记录本反应体系配置说明书 标本制备区工作制度 标准操作、程序文件1.目的:规范样本处理区的配置、功能、内务管理等。2.适用范围:PCR实验室。3负责人: 操作人: 4细则:4.1 配置:冰箱一台,生物安全柜一台,台式高速冷冻离心机一台,混匀器一台,加样器一套,可移动紫外灯?一台,电热恒温水浴箱?一台,空调一台,其它耗
28、品、办公用品若干。4.2 功能: 本区负责各种标本、质控样品的核酸提取纯化,储藏,样本贮存。4.3 内务管理:a. 着装和标识:本区工作服、专用设备均以蓝色?为标识。b. 验人员进入该区须穿本区专用蓝色工作服。实验中须戴一次性手套(手套需常更换)、鞋套或本区专用拖鞋。c. 从传递窗中取出试剂放入冰箱试剂存放专区暂存。d. 记录温湿度计读数和冰箱的温度计读数。(本区每天在工作前利用本区的温控设备使温度控制在15-25之间)e. 核对标本的编号、类型和标本数量。f. 按试剂盒要求进行标本的裂解和提取处理,在生物安全柜上进行加样,加样后低12000rpm离心数秒。g. 使用本室专用的经过无菌处理的加
29、样器和带滤芯的吸头。h. 使用过的离心管、吸头须置于盛有5%施康消毒液的废液缸中。i. 使用带有本室标识的记录本、纸和笔。其他区的用品不得带入本室。j. 患者标本应按有生物传染性危险品对待。k. 标本处理完成后,关闭所有仪器,记录运行状态。l. 走出标本处理区,在缓冲区脱下专用工作服,将手套、鞋套置于专用污物桶中。m. 实验完毕打开紫外灯消毒60分钟。 4.4核酸提取操作规程本实验室使用江苏硕世的核酸提取试剂取200l样品于1.5ml离心管中加入400l Lysis Buffer,振荡混匀,室温孵育10分钟加入450l Binding Buffer (已加无水乙醇),振荡混匀将600l混合液移
30、至一新吸附柱中,412000rpm,离心1分钟;弃废液,将吸附柱放入同一收集管中将剩余混合液移至吸附柱中,412000rpm,离心1分钟;弃废液,将吸附柱放入新收集管中加入400l WB1,412000rpm,离心30秒;弃废液,将吸附柱放入同一收集管中加入600l WB2 (已加无水乙醇),412000rpm,离心30秒;弃废液,将吸附柱放入同一收集管中412000rpm,空柱离心3分钟将吸附柱放入新离心管中,在吸附柱膜中央小心加入50l Elution Buffer,室温静置2-5分钟412000rpm,离心1分钟-20保存备用5.本文涉及以下表格试剂保存使用登记表核酸提取说明书 扩增区工
31、作制度 标准操作、程序文件1.目的:规范基因扩增、分析区的配置、功能、内务管理等。2.适用范围:PCR实验室。3负责人: 操作人: 4细则:4.1 配置:美国伯乐PTC-200型核酸扩增仪一台,ABI7300荧光定量检测仪一台,电脑一台、可移动紫外灯一台?、空调一台、其它耗品、办公用品若干。4.2 功能:进行扩增反应并对产物进行分析。4.3 内务管理:a. 着装和标识:本区工作服、专用设备均以红色为标识。b. 实验人员进入该区须穿本区专用红色工作服。实验中须戴一次性手套(手套需常更换)、鞋套或本区专用拖鞋。c. 从传递窗中取出已加样并离心好的反应管上机扩增。d. 按荧光扩增仪的标准操作文件对各
32、种标本进行检测。扩增结束后对检验结果进行分析。e. 记录温湿度计读数。(本区每天在工作前利用本区的温控设备使温度控制在15-25之间)f. 作好扩增仪的维护、实验数据的记录、质控记录。g. 关闭扩增仪,记录运行状态。h. 实验结束后将已经扩增的反应管放入塑料套袋中密闭后带出,脱下手套、鞋套置于专用污物桶中,由卫生员清除。i. 实验完毕打开紫外灯消毒60分钟4.4核酸扩增操作规程 本实验室使用美国伯乐PTC-200型核酸扩增仪和ABI7300荧光定量检测仪,在此对其操作规范?进行描述a. 伯乐PTC-200型核酸扩增仪操作1 开机,打开电源开关,仪器进行自检(约一分钟结束);2 运行,显示主菜单
33、,运行一个程序: 从主菜单中选择RUN,按Proceed,显示菜单(和自己创建的文件夹)?用Select键选择要运行的程序,按Proceed;3 设置样品管子类型及反应体积在“Vessel Type”项中选择,要使用的(管子、微型板和玻片),按Proceed; 在“Volume”项中输入样品体积(微升)按Proceed;4 在“Use heated lid”中选择程序运行过程中是否热盖,按Proceed;程序开始运行。b. ABI 7300型荧光定量检测仪操作 打开计算机,打开扩增仪电源开关;双击桌面上“7300 System Software”图标,进入ABI 7300程序界面(图1);图1
34、 点击“New document”进入新建实验界面(图2);图2 点击进入模版选择界面(图3);图3 选择hbv后点击按钮,回到前一个界面;点击按钮,进入样本设置界面(图4);图4 在这个界面里,默认所有的孔位都有样品。该图标表示:第35号标本,该图标表示:标准品4,浓度诶5104拷贝/毫升。根据当天标本的实际情况把没有放置标本的孔位去除:首先拖动鼠标将没有放置标本的孔位选中(按住Ctrl键的同时用鼠标选择相应孔位),点击“Hide/Show Well Inspector”,进入选择界面(图5)。图5 将选择框中的“”去掉,变成,点击回到图4,同时被选中孔中的会被去掉。在图5 中请确认中显示的
35、为“(none)”。 输入标准品的方法:请先选择要设置为标准品的孔位点击进入如下界面,将“Task”下选项设置为“Standard”,在“Quantity”下输入相应标准品的拷贝数,如“50000”(图6)图6 设置好标本及标准品后,点击中的进入反应条件设置界面(图7)。图7 一切设定好后,点击“Save Document”,在跳出的如下界面中输入文件名(一般用项目名+年月日表示),如“HBV20060526”(图8).然后点击回到图7。图8 点击进入实验阶段(图中“Start”因为没有联机呈灰色),此时机器会调用实验所需的程序,稍后会出现实验所需时间及实验中的温度变化情况。一般等这些数字显示
36、出来就可以放心离开了。 实验过程中可以点击图7中进入实时荧光PCR界面。点击中的可以进入实时荧光PCR扩增曲线的实时显示界面。 实验结束后分析实验结果并保存数据,退出软件的主菜单;关掉电脑,关闭ABI-7300仪器正面的电源开关.c. ABI 7300型荧光定量检测仪实验结果分析 A. 实验结果无效的判断标准:出现下述四种情况中的任何一种或多种,当次实验结果不可发,查找原因,重做实验。1 阴性对照出现扩增。2 阳性对照无扩增。 3 大批甚至所有的标本都扩增了。4 室内质控检测结果出现失控情况,实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序。 B. 实验结果有效的判断标准:达到下列要求后,当次实验有
37、效,可以发放结果。1 阴性对照没有扩增,阳性对照扩增。2 荧光扩增仪阳性标准品梯度曲线平滑均匀,斜率、截距和相关系数三个参数的数值均在范围内。3 室内质控检测结果处于在控状态。5. 本文涉及以下表格室间质评记录表 PCR室内质控记录表 室内质控图 产物分析区工作制度 标准操作、程序文件1、目的:保证扩增结果分析的标准化、规范化。2适用范围:适用于本室使用的六一仪器的DYY 6C型琼脂糖凝胶电泳仪和美国伯乐BIO-RAD Gel Doc XR 凝胶成像仪。3负责人: 操作人: 4细则:4.1 配置: 凝胶电泳仪一台,凝胶成像仪一台,电脑一台、可移动紫外灯一台?、高压消毒锅一台?、空调一台、其它耗
38、品、办公用品若干。4.2 功能:进行扩增反应产物进行分析。4.3 内务管理:a. 着装和标识:本区工作服、专用设备均以?色为标识。b. 实验人员进入该区须穿本区专用?色工作服。实验中须戴一次性手套(手套需常更换)、鞋套或本区专用拖鞋。c. 从传递窗中取出已扩增好的反应管取样电泳并分析结果。d. 记录温湿度计读数(本区每天在工作前利用本区的温控设备使温度控制在15-25之间);作好仪器的维护、实验数据的记录。e. 关闭仪器,记录运行状态。f. 实验结束后将已经扩增的反应管放入塑料套袋中密闭后带出,脱下手套、鞋套置于专用污物桶中,由卫生员(经培训)清除。g. 实验完毕打开紫外灯消毒60分钟4.4凝
39、胶电泳仪及凝胶成像仪操作规程a. 凝胶电泳仪操作 1 确认电源符合要求后,开启电泳仪的“电源开关”;2 仪器蜂鸣4声后显示上一次工作的设定值;因是重复同一参数使用时,即可直接选择Start后启动;3 按【启/停】键后,仪器鸣响4声,输出启动,“输出指示灯”闪亮,开始工作(当输出稳定后,稳压/稳流状态改变时,仪器会自动鸣响2声以示提醒用户);4 定时到后仪器自动显示已用时间并反复鸣响,关机取出凝胶; B. 凝胶成像仪操作、5 将取出的凝胶置于适当的载物平台上6 关闭暗箱门7 调整滤光片8 打开相应光源9 接下来打开Quantity One软件,选择File中选GelDoc XR菜单,进入图像采集
40、界面10 按下Live/Focus,成像仪进入实时成像11 选择照明模式,一般荧光样品选择UV,普通透射或反射样品选择White模式 12 仪器面板上有三个上下键按钮:IRIS(光圈),ZOOM(缩放),FOCUS(聚焦),可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节13 单击Auto Expose,系统将自动选择曝光时间成像(系统默认0.15%的像素饱和的成像时间为最佳时间,在Options对话框中可以修改该项设置),如不满意,单击Manual Expose,并输入曝光时间(秒) 14 图像曝光满意后,按下“Freeze”按钮15 按下“Analyze”按钮,将弹出一个新窗口显示图像,以供分析1
41、6 第5步结束后,也可以按下“Save”键,保存图像5. 实验结果分析 5.1 实验结果无效的判断标准:出现下述四种情况中的任何一种或多种,当次实验结果不可发,查找原因,重做实验。1 阴性对照出现扩增。2 阳性对照无扩增。 3 大批甚至所有的标本都扩增了。4 室内质控检测结果出现失控情况,实验失控的具体标准详见室内质控标准操作程序。 5.2实验结果有效的判断标准:达到下列要求后,当次实验有效,可以发放结果。1 阴性对照没有扩增,阳性对照扩增。2 室内质控检测结果处于在控状态。6. 本文涉及以下表格 标本的保存操作程序1目的:标本正确保存,以便必要时复查。2适用范围:分子诊断室的所有检测标本。3负责人: 操作人: 4程序:41 处理前的标本保存 标本可4下短期(24h内)保存,长期保存则需取出棉签,保存于-70下。42 报告发出后的标本保存:a) 提取的核酸标本当天检测可置4保存,如当天不检测应置-70保存;报告发出后第二周丢弃。b)原始样本在报告发出后放入低温冰箱-70长期保存,以备复查或送检。c)标本放置低温冰箱保存时须有记录,按编号顺序存放,并由专人负责管理。43 特殊标本的处理:对暂不检测的项目和规定时间外收到的零散样本,要随时登记和交班,以免漏检,遗失和延误检验。标本一律置于-70下长期保存,使用时再按需取出检测。5. 本文涉及以下图表:PCR扩增接收标本记录表
限制150内