王镜岩 生物化学 经典课件 3氨基酸和蛋白质 考研必备 学生物化学必备.ppt

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1、第3章氨基酸,一、氨基酸是蛋白质的构件分子,（一）蛋白质的水解1.酸水解：常用6mol/LHCl回流20h，水解完全，不引起消旋，但色氨酸破坏，羟基氨基酸部分水解，酰胺键水解。2.碱水解：水解完全，会引起消旋，但色氨酸不破坏。3.酶水解：水解不完全，不引起消旋，色氨酸不破坏，主要用于蛋白质的部分水解。,20种氨基酸的发现年代表天冬酰氨1806Vauquelin天门冬芽甘氨酸1820Braconnot明胶亮氨酸1820Braconnot羊毛、肌肉酪氨酸1849Bopp奶酪丝氨酸1865Cramer蚕丝谷氨酸1866Ritthausen面筋天冬氨酸1868Ritthausen蚕豆苯丙氨酸1881S

2、chultze羽扇豆芽丙氨酸1881Weyl丝心蛋白赖氨酸1889Drechsel珊瑚精氨酸1895Hedin牛角组氨酸1896Kossel,Hedin奶酪胱氨酸1899Morner牛角缬氨酸1901Fischer奶酪脯氨酸1901Fischer奶酪色氨酸1901Hopkins奶酪异亮氨酸1904Erhlich纤维蛋白甲硫氨酸1922Mueller奶酪苏氨酸1935McCoyetal奶酪,（二）-氨基酸的一般结构氨基在-位，为L-构型.,二、氨基酸的分类(一)常见的蛋白质氨基酸1.常见的蛋白质氨基酸共二十种。2.按化学结构分为脂肪族、芳香族和杂环族三类。这种分类方法对于研究氨基酸的合成与分解有

3、重要意义。3.按R-基的极性分为非极性R-基氨基酸、不带电荷的极性R-基氨基酸、带正电荷的极性R-基氨基酸、带负电荷的极性R-基氨基酸四类。这种分类方法对于研究氨基酸在蛋白质空间结构中的作用，和对于氨基酸的分离纯化均有重要意义。4.也可将氨基酸分为非极性脂肪族R-基氨基酸、非极性芳香族R-基氨基酸、不带电荷的极性R-基氨基酸、带正电荷的极性R-基氨基酸、带负电荷的极性R-基氨基酸五类。要熟悉氨基酸的结构特点、分类和符号。,注意结构特点,(二)不常见的蛋白质氨基酸,5-羟赖氨酸,4-羟脯氨酸,甲状腺素,3-甲基组氨酸,-N-甲基赖氨酸,-N，N，N-三甲基赖氨酸,-氨基己二酸,-羧基谷氨酸,焦谷

4、氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸,磷酸酪丝氨酸,N-甲基精氨酸,N-乙酰赖氨酸,(三)非蛋白质氨基酸,肌氨酸,-氨基丁酸,甜菜碱,-丙氨基,叠氮丝氨酸O-重氮乙酰丝氨酸,高丝氨酸,羊毛硫氨酸,高半胱氨酸,苯丝氨酸,氯胺苯醇（氯霉素）,环丝氨酸,肾上腺素,组胺,5-羟色氨,青霉胺,鸟氨基,瓜氨基,三、氨基酸的酸碱化学（一）氨基酸的兼性离子形式氨基酸在晶体状态和水溶液中均以兼性离子形式存在。因此,氨基酸有很高的熔点。（二）氨基酸的解离,(三)氨基酸的等电点,1.等电点的定义2.等电点的计算对于R基无解离基团的氨基酸：pI=（pK1+pK2）/2对于R基有解离基团的氨基酸：pI等于等电形式两侧的pK值之

5、和的一半，以等电形式为中心，另一个pK值为第二级解离，可以忽略不计。如Glu:Glu+Glu+-Glu-Glu2-若pH=pI=3.22，根据pH=pKa+log质子受体/质子供体3.22=9.67+logGlu2-/Glu-得Glu2-/Glu-=3.510-7Lys，Arg和His的pI等于两个大的pK值之和的一半；Asp，Glu，Tyr和Cys的pI等于两个小的pK值之和的一半。,2.19,4.25,9.67,(四)氨基酸的甲醛滴定,滴定终点由12左右降到9左右，可以用酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠滴定。,四、氨基酸的化学反应,(一)-氨基参加的反应1.与亚硝酸的反应测量氮气的体积可计算氨

6、基酸的含量。2.与酰化试剂的反应可用于氨基的保护。3.烃基化反应可用于测定多肽链的氮末端氨基酸。4.形成西佛碱的反应为转氨基反应的中间步骤。5.脱氨基反应为氨基酸分解反应的重要中间步骤。,(二)-羧基参加的反应,1.成盐和成酯反应可用于羧基的保护。2.成酰氯反应可用于羧基的活化。3.脱羧基反应是生成胺类的重要反应。4.叠氮反应可用于羧基的活化。,(三)-氨基和-羧基共同参加的反应,1.与茚三酮的反应常用于氨基酸的定性或定量检测。,2.成肽反应,(四)侧链R基参加的反应,1.酪氨酸可发生碘化、硝化、重氮反应，后者可用于检测酪氨酸。2.组氨酸可发生重氮反应。3.精氨酸可与环己二酮发生缩合反应，曾被

7、用于氨基酸序列分析。4.色氨酸可被N-溴代琥珀酰亚胺氧化，生成有色化合物，可用于色氨酸定量测定。5.半胱氨酸可生成烷基衍生物，可用于巯基的保护。巯基可与重金属生成盐，使蛋白质失活。巯基在空气中可被氧化，金属离子对此有催化作用。6.胱氨酸的二硫键可被还原为两个巯基。也可以被过甲酸氧化成两个磺酸基。,N-乙酰马来酰亚胺,半胱氨酸,胱氨酸,碘乙酸,丙烯腈,5，5-二硫双（2-硝基苯酸）,巯基阴离子,对羟基汞苯酸,赖氨酸,希夫碱,五、氨基酸的光学活性和光谱性质1.氨基酸的光学活性和立体化学：氨基酸的不对称碳原子可用D-或L-表示，其比旋值可用于氨基酸的鉴别。,2.氨基酸的光谱性质：芳香族氨基酸的紫外吸

8、收光谱如图所示。,这一性质可用于蛋白质的定量测定。,氨基酸的1HNMR谱,3.氨基酸的核磁共振（NMR）在外加磁场的作用下，原子核的自旋方向达到一致，可以和一定频率的外加磁场共振而形成吸收峰，同一种原子核在分子中的位置不同，因其外围的电子云对核的屏蔽作用引起的吸收峰位置移动（化学位移）也不同，由吸收峰的位置可以推断原子处于哪一个基团，在1HNMR谱中，当相邻基团上有n个质子时，该基团的质子吸收峰将分裂成n+1个峰。,a,a,b,b,c,c,六、氨基酸混合物的分析分离,(一)分配层析法的一般原理,分配系数=物质在流动相中的总量/物质在固定相中的总量,逆流分溶符合二项式的展开式，但对于纸层析和柱层

9、析来说，有关的计算无实际意义。,(二)分配柱层析,可以同检测器、记录仪、馏分收集器、输液泵构成层析系统。,(三)纸层析,Rf主要与R基的极性有关，溶剂的pH可影响R基的极性，氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。,(四)薄层层析,速度快，硅胶等支持物可以使用较强烈的显色方法。,（五）离子交换层析,离子交换树脂的结构如图所示，功能基团种类较多。,氨基酸的离子交换分离原理,若pIpH0，两性离子带净正电荷，若pIpH0，两性离子带净负电荷，差值越大，所带的净电荷越多。,氨基酸的分离过程,用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线（阳离子交换剂）。,（六）气液层析,(七)高效液相层析,HPLC分析氨基

10、酸混合物的洗脱曲线,基本要求1.掌握氨基酸的一般结构和氨基酸的分类；2.掌握氨基酸的酸碱性质和等电点的计算方法；3.熟悉氨基酸的常见化学反应的应用价值；4.熟悉分离和分析氨基酸的常用方法。,作业题第155页第2题；第155页第3题；第155页第5题；第155页第6题；第155页第7题；第155页第8题；第155页第9题；第156页第14题；第156页第15题。,第4章蛋白质的共价结构,、蛋白质通论,(一)蛋白质的化学组成和分类蛋白质的元素组成：C、H、O、N、S,其中含N平均为16%，这一数据可用于蛋白质的含量测定。1.简单蛋白完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分

11、为7类：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀盐溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀碱）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）、组蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于强酸）。2.结合蛋白由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。,3.按蛋白质的生物学功能分类（1）催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。（2）结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总量的1/4

12、；细胞膜、线粒体、叶绿体和内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。（3）运输功能脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白结合才能在血液中运输。,（4）贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。（5）运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改

13、变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。（6）防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质（抗体）来实现的。凝血与纤溶系统的蛋白因子、溶菌酶、干扰素等，也担负着防御和保护功能。,（7）调节功能某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。（8）感觉功能生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如，感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。（9）遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在在染色体中是缠绕在蛋白质（组

14、蛋白）上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。（10）其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。蛋白质的分类如表4-1,4-2,4-3所示（p158)。,(二)蛋白质的形状和大小按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。,蛋白质的相对分子质量差别很大。,（肌联蛋白）,(三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次,蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次：1.一级结构：多肽链的氨基酸序列。2.二级结构：多肽链借助氢键形成的有规

15、则的局部结构，如螺旋、折叠等。3.三级结构：球状蛋白质在二级结构基础上，借助次级键形成的相对独立的完整结构。4.四级结构：具有三级结构的组成单位（亚基）之间的聚合方式。,(四)蛋白质功能的多样性,蛋白质序列的多样性(P160)决定了其功能的多样性。如：20种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为：20！=21018又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假定在肽链的任一位置，12种氨基酸出现的概率相等，则34000/120=28312283=10305,1.催化：大多数酶是蛋白质。2.调节：如激素和反式作用因子。3.转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运

16、蛋白等。4.贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。5.运动：如肌肉、微管蛋白等。6.结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。7.支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。8.防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。9.特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等。,二、肽（一）肽和肽键的结构,肽键的C和N均为sp2杂化，有部分双键的性质，相关的6个原子处于共平面，称作肽平面，肽平面内两个C多处于反式构型。,（二）肽的物理和化学性质肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量（P166表4-6）。肽的化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在,肽可以进行双缩脲反应。,（三）天然存在的活性肽主要有：肽类激素、肽类抗生素和肽类

17、毒素。有关内容将在后续章节介绍。,环状八肽，真核生物RNA合成的抑制剂,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-脑啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-脑啡肽,*,*,均为9肽，仅2个氨基酸有差别，生理功能差别极大。,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-ValL-OrnL-OrnL-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu短杆菌肽S(环十肽)由细菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Ornithine,缩写为Orn）。,三、蛋白质一级结构的测定,(一)蛋白质测序的策略1.确定蛋白质的纯度在97%以上。2.测定多

18、肽链的数目。3.拆分多肽链。4.分析每一条多肽链的氨基酸组成。5.鉴定多肽链的N末端和C末端氨基酸残基。6.用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。7.测定各肽段的氨基酸序列。8.拼接各肽段成完整的多肽链。9.确定二硫键的位置。,(二)N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定1.N-末端的测定（1）二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法):2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,（2）丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯

19、）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到110-9mol,比DNFB法灵敏100倍。,（3）异硫氰酸苯酯(PITC)法:N末端氨基酸生成相应的PTH（苯乙内酰硫脲）AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定。（4）氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N-末端残基。,2.C-末端的测定（1）还原法。C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相

20、应的氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。（2）肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。,（3）羧肽酶法。将蛋白质在pH8.0,30与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以

21、外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。通常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。,（三）二硫桥的断裂,巯基化合物还原法,过甲酸氧化法,（四）氨基酸组成的分析一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，24小时即可完成。蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。,（五)多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化,肽段的分离纯化可用层析法或电泳法,可以用酶水解法或化学水解法将蛋白质水解成肽段,溴化氰断裂法,

22、羟胺断裂法：断裂Asn-Gly之间的肽键，但专一性不强，也可以断裂Asn-Leu和Asn-Ala之间的键.,1.Edman化学降解法:用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为99%，经60次循环，准确度为：0.9960=0.54,(六)肽段氨基酸序列的测定,2.降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。,3.根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录测定cDNA的核苷酸序列,再用遗传密码推定氨基酸序列。,4.质谱法：可分析微量的肽链，短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离，按荷质比分离，依次在经碰撞池

23、被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。,(七)肽段在多肽链中次序的决定肽段,(八)二硫桥位置的确定,用对角线电泳法,(九)蛋白质测序举例（胰岛素的序列测定）,（十）蛋白质序列数据库,1.欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多万条肽链的信息；2.美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。3.美国政府支持的GenBank和欧洲的EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。,四、

24、蛋白质的氨基酸序列与生物功能,（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化,细胞色素C的物种差异,（二）同源蛋白质具有共同的进化起源,1.血红素蛋白与肌红蛋白,3.一些功能差异很大的蛋白质:如溶菌酶和-乳清蛋白功能差异很大,但有序列同源性。蛋白质家族的形成可能有趋同进化和趋异进化两种机制。,2.丝氨酸蛋白酶类:显示明显的序列同源性。,（三）血液凝固与氨基酸序列的局部断裂,1.血液凝固中的级联过程,12中蛋白质凝血因子有7种是丝氨酸蛋白酶,*,*,*,*,*,*,*,与Ca2+结合促进凝血酶原与血小板膜结合，起始凝血酶原的激活,带净负电荷,五、肽与蛋白质的人工合成,（一）肽的人工合成,氨基和羧基的保护,

25、羧基的活化,常用的缩合剂是O,O-二环己基碳二亚(O,O-dicyclohexyl-carbodiimide,DCC),（二）固相肽合成,基本要求1.掌握蛋白质的分类和功能多样性；2.掌握肽的结构特点和基本性质；3.熟悉蛋白质一级结构的测定方法；4.掌握蛋白质一级结构与生物学功能的关系，熟悉有关的典型例子。5.熟悉蛋白质人工合成的基本步骤。,作业题第194页第1题；第194页第2题；第195页第3题；第195页第4题；第195页第8题；第196页第10题。,第5章蛋白质的三维结构,一、研究蛋白质构象的方法,(一)X射线衍射法,基本规律：X射线穿过原子平面层时，当光程差等于波长的倍数，反射波可以

26、互相叠加形成衍射斑点。如图5-2所示，光程差等于2dsin,上述规律可总结为Bragg方程：2dsin=n(n=1,2,3),(二)研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法,1.紫外差光谱芳香族氨基酸在极性环境下吸收峰向短波长移动，称作篮移，反之会红移。2.荧光和荧光偏振变性和非变性蛋白质荧光峰和荧光偏振的位置会有特定的变化。,3.圆二色性,由尼科尔棱镜产生,由电光调制器产生,圆偏振光可看成是相位相差90o的两个平面偏振光叠加而成，若左、右圆偏振光因被测物的吸收而振幅不同，二者叠加会形成椭圆偏振光。椭圆率=短轴/长轴=tan33cl(适合于小的，=RL，c为摩尔浓度，l为光程，为摩尔吸光系数）摩尔椭圆

27、率=/cl100=3300,4.核磁共振(NMR),二、稳定蛋白质三维结构的作用力,（三）疏水作用(熵效应)（四）盐键（五）二硫键,（一）氢键（二）范德华力定向效应诱导效应分散效应,三、多肽主链折叠的空间限制,（一）酰胺平面与-碳原子的二面角（和）：规定键两侧基团为顺式排列时为0o，从C沿键轴方向观察，顺时针旋转的角度为正值。,（二）可允许的和：拉氏构象图,(二)可允许的和值：拉氏构象图,由印度学者Ramachandran制作,四、二级结构：多肽链折叠的规则方式,(一)螺旋1.螺旋的结构多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨

28、基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每一个氨基酸残基的酰胺基团的-NH基与其后第四个氨基酸残基酰胺基团的-CO基形成氢键。蛋白质分子为右手-螺旋。,*,*,3.613螺旋,2.螺旋的偶极矩和帽化,3.螺旋的手性,4.影响螺旋形成的因素：R基太小使键角自由度过大，带同种电荷的R基相互靠近，碳原子上有分支均不利于形成螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成螺旋。,5.其他类型的螺旋,4.416螺旋,(二)折叠片-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm；-折叠结构

29、可以由两条肽链之间形成，也可以在同一肽链的不同部分之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。,-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。反平行式较稳定。,(三)转角和凸起,-转角由四个氨基酸残基组成，弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的N-H之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,(四)无规卷曲无一定的规则,但对一定的球蛋白而言,特定的区域有特定的卷曲方式.,五、纤维状蛋白质,(一)-角蛋白,纤丝,原纤维,初原纤维,卷曲的螺旋,(二)丝心蛋白和其他-角蛋白

30、：折叠片蛋白质,(三)胶原蛋白：胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm。一级结构分析表明，肽链的96%都是按三联体的重复顺序：(g1y-x-y)n排列而成。Gly数目占残基总数的三分之一，x常为Pro，y常为Hpro(羟脯氨酸)和Hlys（羟赖氨酸）。,原胶原蛋白分子在胶原纤维中都是有规则地按四分之一错位，首尾相接，并行排列组成纤维束。这样通过14错位排列便形成间隔一定的（大约70nm)电子密度区域，而呈现

31、横纹区带。,胶原蛋白属于结构蛋白质，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。胶原蛋白至少包括四种类型，称胶原蛋白I、和。腱的胶原纤维具有很高的抗张强度(tensilestrength)，约为20-30kgmm2，相当于12号冷拉钢丝的拉力。骨铬中的胶原纤维周围排列着羟基磷灰石(hydroxyapatite，Ca10(PO4)6(OH)2）结晶。脊椎动物的皮肤含有编织比较疏松，向各个方向伸展的胶原纤维。血管亦含有胶原纤维。,基底膜蛋白聚糖,层黏连蛋白,巢蛋白,胶原蛋白的共价键,吡啶啉是由一个原胶原的N末端区和另一个相邻的原胶原的C末端区之间形成。,随着年龄的增长，胶原蛋白之间的交联键会增多。,(四)弹

32、性蛋白,1.弹性蛋白最重要的特性是富有弹性。2.弹性蛋白不含羟赖氨酸，不被糖基化，不能形成胶原蛋白那样的超螺旋。3.弹性蛋白的一种交联方式是通过羟赖氨酸正亮氨酸衍生物交联。4.弹性蛋白的另一种交联方式是赖氨酸的侧链氧化脱氨基生成醛基，三个醛基和一个未修饰的赖氨酸的侧链形成锁链素和异锁链素，使多条弹性蛋白链交联成肽链网。5.弹性蛋白的肽链形成多种多样的无规卷曲，有张力时，卷曲被拉伸，张力去除后又复原。,（五）肌球蛋白和原肌球蛋白,胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,重酶解肌球蛋白,轻酶解肌球蛋白,M,黄色是轻链结合部位，品红色是轻链调节部位，其余为s1头部。,有些纤维状蛋白质是由球状蛋白质聚集而成的,六、超二

33、级结构和结构域,(一)超二级结构,花边,(二)结构域,黄素氧还蛋白中的-螺旋,柠檬酸合酶中的-螺旋,钙调蛋白中的-螺旋,胰腺胰蛋白酶抑制剂,七、球状蛋白质与三级结构,(一)球状蛋白质的分类:1.反平行螺旋,蚯蚓肌红蛋白,子宫珠蛋白,流感病毒血凝素,烟草花叶病毒蛋白,2.,-结构,丙糖磷酸异构酶（侧）,丙糖磷酸异构酶（顶）,丙酮酸激酶,3.全-结构,大豆胰蛋白酶抑制剂,玉红氧还蛋白,木瓜蛋白酶结构域2,伴刀豆凝集素,晶体蛋白,链霉属枯草杆菌蛋白酶,谷胱甘肽还原酶结构域3,甘油醛-3-磷酸脱氢酶结构域2,4.富含金属或二硫键的蛋白质,胰岛素,磷脂酶A2,高氧还势铁蛋白,铁氧还蛋白,(二)球状蛋白质

34、三维结构的特征1.含多种二级结构元件;2.具有明显的折叠层次;3.球蛋白分子是紧密近似球状的实体;4.疏水侧链在分子内部,亲水侧链在分子表面;5.分子表面有空穴,是结合底物,效应物等配体,行使生物学功能的活性部位,空穴通常是一个疏水的区域。,八、膜蛋白的结构1.具有单个跨膜肽段的膜蛋白,2.具有7个跨膜肽段的膜蛋白,3.桶型膜蛋白-膜孔蛋白,(二)脂锚定膜蛋白,疱症性口炎糖蛋白,甲状腺球蛋白,乙酰胆碱酯酶,糖脂A,*,九、蛋白质折叠和结构预测,(一)蛋白质的变性1.变性蛋白质的特点:空间结构破坏，一级结构完好；活性丧失；溶解度降低；易分解。2.引起变性的因素:加热、辐射、高压等物理因素；有机溶

35、剂、酸、碱、尿素等化学因素。3.变性的协同性:变性发生在较窄的范围内。4.复性:一定条件下可以恢复活性。,7531种可能连接方式中的1种,(二)氨基酸序列规定蛋白质的三维结构,(三)蛋白质折叠的热力学,(四)蛋白质折叠的动力学1.折叠不是随机搜索的过程。2.折叠时先形成局部二级结构，再形成结构域,熔球态，最后形成完整的三级结构。3.折叠时二硫键异构酶和肽基脯氨酸异构酶起重要作用。4.分子伴侣在折叠时有重要作用，主要是防止肽链的错误折叠.。,1.二级结构的预测参照表5-6,按Pi=Ai(被计算的氨基酸残基处于某一二级结构的份数）/Ti(肽链中的各种氨基酸残基处于某一二级结构的份数）的计算值预测,

36、Pi大于1表示该氨基酸残基倾向于形成所预测的二级结构，Pi小于1表示该氨基酸残基倾向于形成其他构象。2.三级结构的预测和计算机模拟原理复杂，已由一些成功的例证。,(五)蛋白质结构的预测,十、亚基缔合和四级结构,(一)有关四级结构的一些概念亚基(单体)，同多聚，杂多聚(二)四级缔合的驱动力主要有范氏作用力，氢键，离子键和疏水作用力，其中疏水作用力最为重要，二硫键对于稳定四级结构有重要意义。(三)亚基相互作用的方式亚基之间的分布有各种各样的对称关系。,(五)四级缔合在结构和功能上的优越性,1.增强结构稳定性;2.提高遗传的经济性和效率;3.构成功能部位;4.为别构效应提供结构基础.,基本要求1.熟

37、悉研究蛋白质构象的主要方法。2.掌握稳定蛋白质三级结构的作用力。3.熟悉多肽主链折叠的空间限制。4.掌握蛋白质的二级结构。5.熟悉主要的纤维状蛋白质的结构特点。6.掌握超二级结构和结构域含义，熟悉其结构特点。7.掌握球状蛋白质的三级结构的特征。8.熟悉膜蛋白的结构特点。9.掌握蛋白质的变性和复性，了解蛋白质折叠的动力学、热力学和结构预测。10.熟悉蛋白质四级结构的特点。,作业题1.第249页第1题；2.第249页第2题；3.第249页第5题；4.第250页第8题；5.第250页第10题；6.第250页第11题；7.流感病毒的凝集素蛋白含有一个53个残基的螺旋,这个螺旋有多长?螺旋中的每个残基与

38、两个氢键有关，这个螺旋中共有多少个氢键？,第6章蛋白质结构与功能的关系,一、肌红蛋白的结构与功能,(一)肌红蛋白的三级结构,(二)辅基血红素,(三)O2与肌红蛋白的结合,(四)O2的结合改变肌红蛋白的构象,(五)肌红蛋白结合氧的定量分析(氧结合曲线),MbO2Mb+O2,K=MbO2/MbO2(1),Y=MbO2/Mb+MbO2(2),Y=O2,/,O2+K,将（1）改写为：MbO2=MbO2/K并代入（2）得：,LogY/(1-Y)=logp(O2)logK,Y=O2/O2+K=p(O2)/p(O2)+K,YK=p(O2)Yp(O2)=p(O2)(1Y),Y/(1Y)=p(O2)/K,二、血

39、红蛋白的结构与功能,(一)血红蛋白的结构,(二)氧结合引起的血红蛋白构象变化,(三)血红蛋白的协同性氧结合(Hb氧结合曲线),(四)H+、CO2和BPG对血红蛋白结合氧的影响1.H+、CO2促进O2的释放(Bohr效应),2.BPG降低血红蛋白对氧的亲和力,链的143位为丝氨酸，而链的143位为组氨酸,三、血红蛋白分子病(一)分子病是遗传的(二)镰刀状细胞贫血病,(三)其他血红蛋白病突变发生在关键部位会致病，突变发生在非关键部位则不会致病。(四)地中海贫血1.地中海贫血每条染色体有1个拷贝，杂合子症状较轻，纯合子会在童年夭折。2.地中海贫血每条染色体有2个拷贝，只要有1个拷贝正常，就不会有严重

40、症状。4个拷贝均丢失会在出生前后死亡。,四、免疫系统和免疫球蛋白,(一)免疫系统1.免疫学的含义免疫是指机体识别并清除从外环境中入侵的病原体及其毒素,和内环境中因基因突变产生的异常细胞,保持内环境稳定的功能。免疫学是研究免疫系统结构,免疫的机制,及利用免疫的方法预防和治疗疾病的学科。,2.非特异性免疫,(1)上皮细胞及其附属成分物理屏障：机械屏障；毛发的保护作用；分泌液的冲洗作用。化学屏障：体液的抗菌作用。微生物屏障：正常菌对病源菌的抑制作用。(2)吞噬细胞的作用识别病原体糖蛋白和糖脂的糖基，可吞噬多种病原体。巨噬细胞：由血液中单核细胞移行到各组织发育而成，可吞噬或杀伤微生物。中性粒细胞：感染

41、发生时，从血管移出，在感染部位吞噬病原体。(3)自然杀伤细胞（NK细胞）其细胞表面有两种受体杀伤细胞活化受体（KAR）：识别病毒感染细胞和肿瘤细胞表面的糖基，与其结合后生成穿孔素和水解酶使靶细胞死亡。同时产生干扰素-，肿瘤坏死因子等细胞因子，激活特异性免疫系统。杀伤细胞抑制受体（KIR）：识别自身正常细胞表面由MHCI展示的，由自身蛋白分解产生的肽段，抑制杀伤作用。,3.特异性免疫病原体及其分解产物刺激特定的免疫细胞增殖，清除特定的病原体。通过分泌可溶性抗体清除特定抗原的途径称体液免疫。通过免疫细胞与受感染细胞结合而清除受感染细胞的途径称细胞免疫。,(2)体液免疫,由骨髓的多能造血干细胞发育而

42、成的B细胞种类极多，每种B细胞含有一种多个特定的受体(BCR,实际是膜结合的抗体)。抗原与BCR结合后，通过细胞内信号转导系统启动细胞的快速分裂，使细胞大量增殖。增殖后的细胞大部分用来产生可溶性抗体，称作浆细胞，一小部分用来产生膜结合抗体，并长期生存，称记忆细胞。同种抗原再次入侵时，记忆细胞可快速启动免疫系统，疫苗就是根据这一原理设计的。抗体可结合抗原，并使其失活，称中和作用。抗原-抗体复合物可以与吞噬细胞的Fc受体结合，促进吞噬作用，称调理作用。抗原-抗体复合物可以与补体结合，补体使病原体穿孔崩裂，还可促进抗原-抗体复合物与吞噬细胞结合。,(3)细胞免疫,由骨髓迁移到胸腺发育而成的T细胞种类

43、极多,每种T细胞含有一种多个特定的T细胞受体(TCR)。T细胞按功能主要分为两个亚群:Tc细胞(细胞毒性T细胞)的受体与抗原肽-MHCI（主要组织相容性复合体I）复合物结合后,细胞被激活并大量增殖,增殖后的细胞产生穿孔素和颗粒酶,使受感染的细胞裂解,还可以使DNA内切酶激活,造成细胞凋亡。TH细胞(辅助性T细胞)的受体与抗原肽-MHCII（主要组织相容性复合体II）复合物结合后,细胞被激活并大量增殖,产生多种细胞因子。细胞因子与Tc细胞、TH细胞、B细胞和吞噬细胞的特异性受体结合,促进其增殖。TH细胞还可以促进一些抗原与B细胞结合,因此,TH细胞功能障碍会引起严重的疾病,如HIV引起的艾滋病。

44、,4.免疫组织和器官,骨髓和胸腺是B细胞和T细胞发育成熟的器官,称作中枢淋巴器官。免疫细胞经血管和淋巴管网络在全身循环,并可在淋巴结和脾脏聚集,淋巴结和脾脏称作外周淋巴器官。上皮细胞下常有淋巴细胞聚集,因无包膜,称作淋巴组织。,(二)免疫系统能识别自我和非我,存在于几乎所有细胞的表面，展示细胞内蛋白质分解产生的肽段,介导其与相应的Tc细胞结合。能识别自身蛋白质分解产生的肽段的Tc细胞在发育过程中被清除。,存在于巨噬细胞和B细胞的表面，展示外来蛋白质分解产生的肽段。介导其与相应的TH细胞结合。,(三)在细胞表面的分子相互作用引发免疫反应,(四)免疫球蛋白的结构和类别1.免疫球蛋白的结构免疫球蛋白

45、G(IgG)是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的重链(heavychain)和两条相的轻链(lightchain)。四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。,2.免疫球蛋白的类别按照重链的类型分为:重链轻链IgG或IgA或IgM或IgD或IgE或,IgM,IgG是记忆B细胞引发的再次免疫反应的主要抗体，可以通过胎盘。IgA是存在于唾液、泪液、乳汁等分泌物的主要抗体，可以是单体、二聚体或三聚体。,IgM是初次免疫反应早期产生的，可以以单体形式与膜结合，或形成5聚体。IgD主要存在于B细胞表面，功能不详。IgE与过敏源结合

46、诱导细胞产生组胺和其他活性胺，使血管扩张，渗透性增大，引起炎症反应。,(五)基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法1.酶联免疫吸附测定,2.免疫印迹测定,3.单克隆抗体的制备,1.用选定的抗原免疫小鼠,取出脾脏,制备B淋巴细胞。2.培养小鼠的骨髓瘤细胞。3.B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。4.转移到只有杂交瘤细胞才能生长的培养基上,培养选择杂交瘤细胞。5.用ELISA筛选产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞。6.用小鼠腹水或培养箱培养选出的杂交瘤细胞。7.纯化所需的单克隆抗体。,五、肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩(一)肌纤维的结构,(二)肌原纤维由粗丝和细丝构成,(三)骨骼肌的相关蛋白质M盘中主要含M蛋

47、白、肌中蛋白和肌酸激酶，后者可以促进ATP的快速再生。与Z盘相关的主要有-辅肌动蛋白、结蛋白和波形蛋白等。细胞骨架蛋白主要有肌连蛋白和伴肌动蛋白，肌连蛋白是一种弹性蛋白，可以防止肌肉过分伸长。,（四）肌肉收缩的机制,基本要求1.熟悉肌红蛋白的结构与功能。2.掌握血红蛋白的结构与功能。3.熟悉血红蛋白分子病。4.熟悉免疫系统和免疫球蛋白。5.熟悉肌球蛋白丝、肌动蛋白丝与肌肉收缩。6.了解蛋白质的结构与功能的进化。,作业题1.第287页第1题；2.第288页第2题；3.第288页第4题；4.288页第5题；5.第288页第6题；6.第288页第7题；7.第288页第9题。,第7章蛋白质的分离纯化和

48、表征,一.蛋白质的酸碱性质各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。二.蛋白质分子的大小与形状（一）根据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。,例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu的百分含量计算，最低MrX1：X1=(100131)/1.65=793

49、9.4按照Ile的百分含量计算最低MrX2：X2=(100131)/2.48=5282.3由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：X1/X2=7939.4/5282.31.5这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：7939.42=15878.8或5282.33=15846.9,（二）渗透压法测定相对分子质量,（三）沉降分析法测定相对分子质量,基本原理：离心力（centrifugalforce，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义：F=ma=m2ra粒子旋转的加速度，m沉降粒子的有效质量，粒子旋转的角速