不同剂量地塞米松对液压冲击伤脑水肿AQP4表达的影响.docx

《不同剂量地塞米松对液压冲击伤脑水肿AQP4表达的影响.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《不同剂量地塞米松对液压冲击伤脑水肿AQP4表达的影响.docx（71页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本 学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。 河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学 位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材 料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则， 承担相应的法律责任。 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写

2、，文责自负。 目 录 中文摘要 . 1 英文摘要 . 5 研究论文不同剂量地塞米松对大鼠液压冲击伤脑水肿 AQP4 表达 的影响 弓 . 9 第一部分大鼠液压冲击伤神经功能评分与 AQP4 表达的 关系 |J s . 10 材料与方法 . 11 结果 . 15 P 細 . 17 醜 . 20 i 寸 i 仑 . 22 純 . 23 参考文献 . 24 第二部分不同剂量地塞米松对大鼠液压冲击伤脑水肿 AQP4 表达 的影响 |J s . 27 材料与方法 . 28 .31 P 細 . 34 醜 . 47 讨论 . 51 純 . 52 参考文献 . 53 仑 . 55 综述水通道蛋白 4 在创伤性

3、脑水肿中的作用研究 . 56 致谢 . 67 个人简历 . 68 中 文 摘 要 不同剂量地塞米松对液压冲击伤脑水肿 AQP4 表达的影响 第一部分 摘 要 大鼠液压冲击伤神经功能评分与 AQP4 表达的关系 目的：建立液压冲击脑损伤动物模型，观察神经功能评分和 AQP4 的表达 规律，探讨神经功能评分与 AQP4 和脑水肿的关系。 方法：雄性成年 SD 大鼠 56 只，体重 250-350g，随机分为 3 组：空 白对 照组 （ NC 组） 4 只，假手术组（ SO 组） 4 只，损伤组（ TBI 组 ） 48 只，再随机 按伤后 lh， 6h, 12h， 24h, 3d,7d 六个时间点分

4、为 6 组，每组 8 只 . 按文献制作液 压冲击伤动物模型。 SO 组动物常规麻醉开颅，但不进行液 压冲击， NC 组不进 行任何处理。 NC 组和 SO 组于术后， TBI 组于术后第 lh、 6h、 12h、 24h、 3d 和 7d 各时间点先行神经功能评分，再 10%水合氯醛过度麻醉，断头处死，开颅 取脑， 行 HE 染色和免疫组织化学染色方法检测 AQP4。从损伤区前缘取 100mg 左右 脑组织应用干湿重法测脑组织含水量。损伤区后缘脑组织用于 免疫蛋白印迹 (Western Blot)检测 AQP4 蛋白表达。 结果： 1 动物一般状况 :大鼠在液压冲击伤后均立即出现前肢抱握屈曲

5、、肌张力 增高、 竖毛、弓背、心率增快等表现，且可出现呼吸暂停，持续时间约 (15 2)s，一般 可自行恢复呼吸。随后昏迷、反射减弱。清醒后精神萎靡不 振，活动减少。 2 神经功能评分： TBI 组与 SO 组比较，在伤后各个时间点评分降低 (P . 5)。自伤后 6h 脑组织含水量开始增加 (79.36 士 1.09)%， 在伤后 24h 时达到最高 (82.190.97)%，持续至 3d(81.74 土 1.690%，然后开 始下降， 7d 时 (80.450.7)%基本恢复。 4 中 文 摘 要 D1 组、 D2 组、 D4 组与 DO 组趋势一致。 D1 组、 D2 组和 D4 组在

6、lh 时 分别与损伤组比较，差别无统计学意义（ P0.05)。 D1 组、 D2 组、 D4 组在伤 后 6h、 12h、 24h、 3d 和 7d 与损伤组比较，差异有统计学意义 (P0.05)。 4 AQP4 蛋白及其 mRNA 表达： DO 组和干预组 AQP4 蛋白及其 AQP4mRNA 均是在伤后 24h 时达到高峰值，并持续到 3d。干预组在 6h， 12h， 24h， 3d 和 7d 与损伤组比较差异有统计学意义（ P0.05)。 结论： 1 地塞米松能够通过下调 AQP4 及其 mRNA 的表达来发挥减轻脑水肿的 作用。 2 不同剂量地塞米松对 AQP4 和脑水肿的影响无统计学

7、意义，提示临床 应用地 塞米松应早期、小剂量、短期为佳。 关键词：糖皮质激素；地塞米松；脑水肿； AQP4;冲击伤。 5 英 文 摘 要 Effective of different doses of dexamthasone on AQP4 expression after fluid percussion injury in rats ABSTRACT Part I The relationship between the expression of AQP4 and nerve function scores after fluid percussion injury Objective

8、: To establish animal model of fluid percussion injury and explore the relationship between AQP4 and nerve function scores in rats Methods: Adult male Sprague-Dawley rats (250-350g) were used in this study. The rats were randomly divided into three exerimental groups: NC group(n=4),sham group(n=4),T

9、BI group(n=48).The TBI group was also randomly divided into three exerimental sub-groups according to the time points of sacrifice such as lh, 6h, 12h, 24h, 3d and 7d after injury. We established the fluid percussion model following documents. Sham-operated rats were anesthetized and surgically prep

10、ared in the exact same maimer, but did not receive FPI brain injury. NC group did not accepted any treatment. Under 10%cholralhydrate anesthesia, the group of NC and SO was killed by decapitation after injury,TBI group was disposeded with same way at lh, 6h, 12h, 24h, 3d and 7d after injury.The hist

11、ology was detected by HE staining, the expression of AQP4 was detected by immunohistochemical and western blot. The brain water content (BWC) was measured by Wet-Dry Method in each group. Results: 1 After fluid percussion injury, the rats immediately appeared grasp hole forelimb flexion, and increas

12、ed muscle tone, vertical hair, and there may be apnea duration of about (152)s. Followed by coma, reflecting weakened. Conscious spiritual malaise and reduced activities existed. 6 英 文 摘 要 2 Neurological score: The Neurological score of TBI group increased from lh, showed inflection point in the 12h

13、 after injury,and then began to reduce at 24th h, lasted to 3rd day, increased from 3rd day, and nearly returned to normal level at 7th day . 3 Histological observation: cellular edema in lesions around the TPI can be seen at 6h after the injury. Brain edema at 12h after injury became much severe th

14、an before. At 24h after injury, edema further expanded the scope and depth from the damage to the white paper around the development of lesions, and edema reached peak. The edema can be observed at 3d after injury, but was lower than that at 24h and the proliferation of glial cells was highter than

15、obvious; At 7d after injury, edema nearly disppeared and glial cell proliferation was still evident. 4 The water content: the water content of TBI group increased from 6h(79.21l. 9%) , reached its peak at 24th h (82.190.97%), lasted to 3rd day (81.741.69%), and then began to reduce, nearly to normal

16、 level at 7th day (80.450.7%). 5 Immunohistochemical analysis: The expression of AQP4 increased in TBI model group from 6h (0.17380.076), reached its peak at 24th h(0.19120.085), lasted to 3rd day (0.17880.099), and then began to reduce, nearly to normal level at 7th day . 6 Western Blot: The expres

17、sion of AQP4 increased from 6h (0.38960.098), reached its peak at 24th h (0.72110.0784),lasted to 3rd day (0.56170.0726), and then began to reduce,nearly to normal level at 7th day . 7 Relativity: Neurological score from 12h to 7d after injury has a negative correlationship with brain water content

18、(r=-0.615,P0.05). Compared with sham operated group, the water content of DO group increased from 6h(79.361.09%) , reached its peak at 24th h(82.190.97%), lasted to 3rd day(81.74l.69%), and then began to reduce, nearly return to normal level at 7th day (80.450.7%). Compared with DO group at the corr

19、esponding time points, the difference of water content in D1,D2 and D4 group was statistically significant (P . 5)。 TBI 含水量从伤 6h 开始增加 (79.36 0.43)%， 24h 时达到最大值 (82.19 0.97)%，持续至 3d(81.74 士 1.69)%， 7d 开始下降 (80.450.71)%,基本至 6h 时的水平。其变化趋势 呈峰状。损伤组与假手术组比较差异有统计学意义 (P1，在 1.5%琼脂糖凝胶 (含 EB)上电泳， 80V， 45min。 用

20、UVP 凝胶图像成像系统拍摄结果，用凝胶图像分析系统（ Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果，以相对光密度值（ IOD)表不。 3 统计学分析 :同第一部分 结 果 1 组织学观察 D0 组动物液压冲击伤后 lh 后可见挫裂伤灶结构破坏，点片状出血 (见 Fig.7a)。 伤后 6h 开始出现细胞水月中，神经元周围的间隙增宽 (见 Fig.7b)。 伤后 24h 水肿 范围进一步扩大，达到高峰，神经元和血管周围间隙增大， 并出现了胶质细胞的增 生；且神经细胞周围水肿，间隙变宽 (见 Fig.7d)。 伤后 3d 仍可观察到周围水肿， 但较 24h 时有所减轻，胶质

21、细胞比之前增 生明显 (见 Fig.7e)。 7d 后水肿基本减退， 胶质细胞增生更加明显，神经细 胞及胶质细胞水肿明显减轻，炎症细胞大量浸润 (见 Fig.7f)。 Dl、 D2、 D4 组各个时间点与 DO 组比较，脑水肿程度和范围有所减 轻， 细胞肿胀减弱，胶质细胞肿胀轻微，神经元较前改善，周围间隙缩小 (见 Fig.8 Fig.13)。 2 神经功能评分 D0 组在伤后 lh(9.31.03)开始神经功能评分逐渐升高，并持续至 12h(11.170.75)，到 24h(10.170.75)则出现神经功能评分下降，到伤后 3d(10.661.37)时评分有所升高，但仍低于 12h 时，到

22、术后 7d(13.670.52) 基本恢 复。三组干预组的神经功能评分较 DO 组有所升高，在 6h、 12h、 24、 3d 时与 DO 组比较差异有统计学意义 (P . 5)(见 Tab 6,Fig.27)。 研 究 论 文 32 3 脑组织含水量 DO 组含水量伤后 lh(77.960.83)%比假手术组稍高，但差异无统计 学意 义 ”0.05)。 0 组含水量从伤 611 开始增加 (79.360.43)%，于 2411 时达到 最大值 (82.190.97)。 /。 ，持续至 3d (81.740.99)%， 7d 下降 (80.450.71)%， 基本恢复至 6h 时的水平，整个变

23、化趋势呈峰状。 DO 组与 SO 组比较差异有统计学意义 (P0.05)。 伤后 6h 低于 D0 组 ， 比较差异有 统计 学 意义 （ P0. 5)，（ 见 Tab5)。 4 免疫组织化学观察 脑组织 AQP4 蛋白主要表达于星形胶质细胞和室管膜细胞内，尤其富 集于 与毛细血管和软脑摸直接接触的星形胶质细胞足突中，且靠近基底膜 最 明 显 。 D0 组 动 物 水 肿 脑 组 织 AQP4 表 达 于 后 6h 开 始 增 加 (0.17380.0765)， 伤 后 24h 达 最 高 峰 (0.19120.0858) ， 持 续 至 伤 后 3d 后 开 始 下 降 ( .17880.0

24、999)，在 7d 时仍高于假手术组 (见 Fig.14)。 干预组中 D1 组、 D2 组和 D4 组每组内 AQP4 蛋白的表达变化趋势也 呈 峰状表现：在伤后 6h 逐渐开始增加，在 24h 时表达达到最大值，并持 续至 3d， 之后开始下降，于 7d 时仍较高 (见 Fig.15 21)。伤后 lh 三组稍 小于 D0 组， 差异无统计学意义 (P0.05)。在伤后 6h、 12h、 24h、 3d 和 7d 三组分别与 DO 比较，在相应时间点都低 DO 组，差异有统计学意义 (卩 .05)。 5 Western blot 测 AQP4 蛋白表达 D0 组 在 水 肿 脑 组 织 A

25、QP4 蛋 白 表 达 在 伤 后 6h 开 始 增 尚 (0.38960.098)，于 24h 达最大值（ 0.72110.0784)，持续到 3d 开始下 降 （ 0.56170.0726)，至 7d 仍高于正常脑组织 (见 Fig.24a)。 研 究 论 文 33 干预组中 D1 组、 D2 组和 D4 每组内趋势与 DO 组趋势一致，在伤 后 6h 开 始增大， 24h 达最大值，在 3d 开始下降 (见 Fig.24 25)。三组分 别与 DO 组比较， 在伤后 lh 时差异无统计学意义（ P0.05)。在伤后 6h、 12h、 24h、 3d 和 7d 三组 分别与 DO 比较后，

26、发现均低于 DO 组，差异有 统计学意义（ P0.05)，（ Tab9)。 6 AQP4mRNA 表达 DO 组水肿脑组织 AQP4mRNA 表达量呈先增高后逐渐减低趋势，与 免疫 组化所测蛋白表达趋势一致。在 6h 开始增加 (0.63170.0494)，在 24h 达到高 峰 (0.78690.0644)， 持 续 至 3d 之后开始下降 (0.74980.0244)，在 7d 仍处 于较高水平 (见 Fig.22b)。 干预组中 D1 组、 D2 组和 D4 组的 AQP4mRNA 的表达趋势与损伤组 致 (Fig.22 23)。伤后 lh 三组动物分别与 DO 组比较差异无统计学意义

27、(P0.05)。但 伤后 6h 低于 DO 组，差异有统计学意义（ P0.05) (Tab 8)。 7 相关性分析 大鼠液压冲击伤模型中脑含水量与 AQP4 蛋白表达呈相关性 (r=0.84, P0.05(compared within D1,D2,D4) Table 6 Neurologic score in each group Group N DO D1 D2 D4 NC 4 15 - - - SO 4 15 - - - 7d 8 13.67 士 0.52* 12.980.76*# 13.510.68*# 12.960.91#* NC: saline group.SO:sham oper

28、ated. *p 0.05(compared within D1,D2,D4) lh 8 78.460.98 77.960.8 78.030.99 77.720.95 6h 8 79.360.43* 78.290.96#A 77.890.96#A 77.780.94#A 12h 8 80.231.47* 79.030.87#A 79.021.1#A 78.20.75#A lh 8 9.31.03 10.170.72 100.89 10.17 士 0.77 6h 8 9.830.75* 110.89#A 11.170.98#A 11.51.38#A 12h 8 11.170.75* 11.970

29、.52#A 12.050.84#A 12.170.75#A 24h 8 10.170.75* 11.830.75#A 11.671.03#A 11.830.98#A 3d 8 10.661.37* 11.671.03#A 11.831.17#A 12.000.89#A 49 Table7 Immunohistochemical analysis of AQP4 expression at post injury Group N DO D1 D2 D4 NC 4 0+15090. 0691 - - SO 4 0.15020.0783 一 一 lh 8 0.1540 . 589 0.149 牡 0

30、.0399 0.1583 . 927 0.155 牡 0.0441 6h 8 0.17380.0765* 0.15930.0123#A 0.16080.0971#A 0.15730.0843#A 12h 8 0.1769 . 118*0.1651 . 565#A 0.1653 . 518#A 0.1579 . 441#A 24h 8 0.1882 . 858*0.1710 . 481#A 0.1699 . 476#A 0.1646 . 428#A 3d 8 0.17880.0999* 0.16750.0395#A 0.16260.0632#A 0.157 牡 0.0658#A 7d 8 0+1

31、713 士 0+0117* 0+1601 士 0+0313#A 0+1585 士 0+0668#A 0.1570 0.0806#A NC:saline group.S0:sham operated.*p 0.05(compared within D1,D2,D4) Table8 The expression of AQP4mRNA in the RT-PCR Group N DO D1 D2 D4 一 一 一 一 lh 8 0.55610.0549 0.5313 . 1082 0.43920.0581 0.3145 . 1243 6h 8 0.63170.0494* , 0.41990.124

32、0 0.35950.1422 0.35060.1518 12h 8 0.68720.0711* 0.46790.2160 0.4131 . 949 0.35890.0903 24h 8 0.78690.0644* 0.61050.1282 0.59450.0903 0.49330.1319 NC 4 0.22010. 1094 一 SO 4 0.22170. 1184 一 研 究 论 文 50 SO 4 0.1531 * #A #A #A #A Table9 The expression of AQP4 protein in the Western Blot NC 4 0.15290. 086

33、4 0.0501 lh 8 0.20760.0626 0.20310.0178 0.11990.088 0.11950.0143 0.38960.0981 * 0.33180.0108 12h 8 0.64710.0469 社 / 0.21680.0957 0.20040.0102 * 0.54690.095#A 0.49650.0459#A 0.41970.075#A 0.7211 . 784* 3d 8 0.56170.0726 7d 8 0.49310.0975 0.58210.0539# A 0.51340.0524 .4943 . 91 0.49830.0159# A 0.43170

34、.0195 0.38470.086 社 / 0.40030.0945 * 0.36990.0785 0.34690.052 NC: saline group. SO:sham operated. *p 0.05(compared within D1， D2， D4) Group N DO D1 D2 D4 6h 8 24h 8 研 究 论 文 51 讨 论 创伤性脑损伤 （ traumatic brain injury,TBI)逐渐成为全球最大的公 共健康安全问题 5。创伤性脑损伤引起的脑水肿导致脑灌注量下降、局部 缺血 缺氧、神经功能损伤以及颅内压升高，均是导致致残或者致死的重要 因素。在

35、创伤性脑水肿中，早期因能量相关机制的衰竭引起细胞内离子的 聚集，导致出 现了细胞性脑水肿，细胞外离子和水分子的减少迫使更多的 分子通过血脑屏障 渗透进脑组织，出现毛细血管内皮细胞和胶质细胞的肿 胀，导致血脑屏障的破 坏，渗透性增加，脑组织水分进入脑组织，逐渐形 成血管性脑水肿，细胞性脑 水肿是不可避免出现的细胞肿胀和坏死等变化 的前奏，并且是形成脑水肿的驱 动力 6。因此早期抑制脑水肿的发生发展 地神经功能的恢复至关重要。 本实验发现，中度液压冲击伤的大鼠脑含水量从伤后 6h 开始升高， 伤后 12h 时持续加重， 24h 时脑含水量达到最大值，持续到 3d 之后开始 下降，到伤 后 7d 基

36、本恢复，但仍高于正常组织。而 AQP4mRNA 和蛋白 的表达也是在伤 后 24h 时达到高峰，并持续到 3d，相关性分析脑水肿与 AQP4 的表达呈正相关。 表明在大鼠中度液压冲击伤 AQP4 的上调参与了 脑水肿的形成。 KaraSum 研究自 由落体撞击伤模型，发现损伤组脑含水量 较正常组明显增加， AQP4 表达量也 明显增加；用蛋白激酶 C 活化剂 后，脑组织含水量较少， AQP4 的表达量也减 少，提示两者呈相关性。 这与本实验结果一致。 Yang8等则利用转基因小鼠研 究胶质细胞 AQP4 作用，也发现 AQP4 的过度表达可以加快细胞毒性脑水肿的 形成，并增加 颅内压，而 AQ

37、P4 基因敲除大鼠脑含水量和颅内压则明显下降。 Jamie9 制作加速脑损击模型，观察到 AQP4mRNA 表达开始于伤后 lh， AQP4 蛋 白开始表达在伤后 4h，并与脑含水量呈相关性。因此，调控 AQP4 表 达可能成 为治疗脑水肿的新靶点 1()。王锐 11等对豚鼠采用自由落体模型 实验得出，利用 大剂量地塞米松 （ 4 mg/kg)可抑制外伤性的脑血管扩张 充血，并能明显减少钙 颗粒的沉积，抑制胞核胞浆异常化的改变，减少 细胞内外水肿的形成，主要机 制是通过稳定血脑屏障。而其他剂量地塞 米松是否可以通过调节 AQP4 的表达 来影响脑水肿的形成则需要进一步 证明。 研 究 论 文

38、52 糖皮质激素是临床上治 疗 各种原因脑水肿的常用药物之一，其中 地 塞 米 松 最 为常 用 ，其化 学 名称 为 ： 16a-甲 基 -lib,17a,21-三 羟 基 -9a-氟 孕 甾 _1,4_二 烯 -3,20-二酮 -21-醋酸酯。由于其分子结构上的 9-a 氟基使其抗炎作 用比强的松增 加 30 倍，而 16-a 甲基使其盐皮质功能减弱， 1.2 位双键使 血清半衰期延长到 5 小时。因而其作用持续时间相对较长，很少有水盐代 谢失衡的临床症状发生， 并且有实验证明在 TBI 后给予大剂量地塞米松 可以调节神经生长因子（ NGF) 和脑源性神经营养因子（ BDNF)的 mRNA

39、 活性来保护神经细胞 1213。 1999 年 -2004 年，完成了严重 TBI 后应用 GCs 的随机抽样前瞻性的实验（ CRASH)， 结论是 TBI 患者伤后 2 周内应用糖 皮质激素没有降低死亡率，然而其死亡危险 度有所增加 14。但 CRASH 研 究只是针对 TBI 患者伤后早期（ 8h)的大剂量糖 皮质激素的应用进行了 评估，其不能代表 TBI 后其他时间段、其他剂量和类型 糖皮质激素的治 疗效果。因此，在本研究中我们在不同的时间段应用不同剂量 的地塞米松 (lkg/mg-4kg/mg)来观察其对脑水肿的影响，发现应用地塞米松后脑 组 织含水量明显减少，并且 AQP4 蛋白及其

40、 mRNA 的表达也明显下降，表 明 地塞米松能够通过下调 AQP4 蛋白及其 mRNA 的表达，来实现缓解脑 水肿的 作用。 Ron 等 15应用人的治疗剂量治疗成年羊脑损伤，也发现地 塞米松也可以 降低 AQP4 的表达。 长期大剂量激素的应用会影响体内的内分泌机制，可导致应激性溃 疡、 感染以及撤药综合症 16。本研究发现大剂量（ 4kg/mg) 对 脑 含 水 量 以及 AQP4mRNA 和蛋白的调节作用较强，但与小剂量组 (lmg/kg)比较无 统计学意 义。因此，为避免地塞米松的副作用，临床应用还是以小剂量、 短期为佳。 小结 1 地塞米松能够通过下调 AQP4 及其 mRNA 的表达来发挥减轻脑水肿的 作用。 2 不同剂量地塞米松对 AQP4 和脑水肿的影响无统计学意义，提示临床 应用地 塞米松应早期、小剂量、短期为佳。 53 研 究 论 文 参考文献 1 Rosenberg GA,Cunningham LA,Wallace J,et al. Immunohistochemistry of matrix metalloproteinases in reperfusion injury to rat brain: activation of MMP-9