专题2细胞工程知识点梳理(含教材答案).doc

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1、专题2 细胞工程 细胞工程的概念：是指导应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。（是指以细胞为基本单位，在体外无菌条件下，进行培养、繁殖或利用细胞融合、核移植等技术，使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良生物品种、创造新品种和加速繁育生物个体，以及获得某些有用的细胞代谢产物的技术。）应用的原理和方法：细胞生物学和分子生物学操作水平：细胞（细胞器）水平的操作研究的目的：按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品(定向改造） 细胞工程的类型1、按研究对象可分为：植物细胞工程、

2、动物细胞工程、（微生物细胞工程）2、按所用技术可分为：l 植物组织培养、植物体细胞杂交l 动物细胞培养、动物细胞融合和单克隆抗体制备、细胞核移植技术和动物体细胞克隆一、植物细胞工程 （属于无性繁殖）有性生殖、无性生殖1.无性生殖 概念：不经过两性生殖细胞的结合，由母体直接产生新个体的生殖方式。种类:项目种类概念举例 共同点分裂生殖由一个生物体直接分裂成为两个新个体。这两个新个体，大小和形状基本相同。草履虫细菌新个体是由母体直接产生出来，新个体所含的遗传物质与母体的相同，因而新个体能够保持母体的一切性状。出芽生殖在母体的一定部位上长出芽体。芽体长大以后从母体上脱落下来，成为与母体一样的新个体。水

3、螅、酵母菌孢子生殖真菌和一些植物，能够产生一种无性的生殖细胞，称孢子。孢子在适宜的环境条件下，能够萌发并长成新植株。根霉、铁线蕨营养生殖植物体营养器官的一部分，在与母体脱离后，能够发育成为一个新个体。草莓、马铃薯优点：保持优良品种的遗传特征。2.有性生殖.概念：由亲本产生有性生殖细胞，经过两性生殖细胞的结合，成为合子，再由合子发育成新个体的生殖方式。.意义：产生的后代具备了双亲的遗传特性，具有更强的生活力和变异性，对于生物的生存和进化具有重要的意义。（一）理论基础（原理）：细胞全能性1细胞全能性的概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个生物细胞都

4、具有全能性的特点。2.理论依据：生物体内几乎每一个细胞内都含有该物种的全套遗传物质，具有发育成为完整个体所必需的全部基因。3.全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞；分化程度低的细胞分化程度高的细胞4. 实现全能性的条件（1）离体状态。（2）环境条件条件适宜（如营养物质、激素、温度等）。5.植物体中体细胞未表现出全能性的原因理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植物的潜力，但是在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种器官和组织，是因为在特定的时间和空间条件下，细胞的基因会有选择的表达出各种蛋白质，从而构成生物体的不同组织和器官。（基因选择性

5、表达。即未离体细胞只能在机体的调控下定向分化，不能表达其全能性。）【特别提示】目前的实验证明，离体的植物体细胞的全能性得到了充分的体现（如植物组织培养）。离体的动物体细胞，其全能性受到限制，细胞核具有全能性（如克隆技术培养动物个体，需要去核卵细胞的细胞质才能体现出来。）；动物体细胞克隆的关键是细胞核移植技术。 细胞分化（1）概念：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。（2）原因：不同的细胞中遗传信息的执行情况是不同的。（3）特点：普遍性、持久性、稳定性、不可逆性（4）意义：细胞分化是生物个体发育的基础。（二）植物细胞工程的基本技术：植物组织

6、培养，植物体细胞杂交技术1.植物组织培养技术(1)概念：是指依据细胞全能性的原理，在无菌和人工控制条件下，将离体的植物的器官、组织、细胞或原生质体（称为外植体），培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整植株。（长成部分或完整植株的技术。）(2)理论基础：植物细胞的全能性。(3) 条件：离体、无菌、营养物质、激素、光照等其他适宜条件。首先用消毒剂除去外植体表面的微生物，在无菌条件下将其放到适宜的培养基上。培养基一般有五类成分：水无机营养：包括大量元素和微量元素。有机营养：主要有糖、维生素、氨基酸。生长物质：指植物激素，常用的有生长素（利于生根）和细胞分

7、裂素（利于生芽），离体培养物的根芽分化取决于激素间的比例。此外，赤霉素对刺激细胞的伸长也有一定的作用。天然附加物：如椰子乳、酵母提取物等。(4)过程：离体的植物器官、组织或细胞脱分化愈伤组织再分化试管苗 植物体 （外植体消毒） 生长素及细胞分裂素（避光） 生长素及细胞分裂素（给光）植物组织培养过程：取外植体（离体的器官、组织、细胞），注意要消毒（可用次氯酸钠、无菌水处理，在超净工作台上操作）；将外植体接种到培养基，并封口（培养基成分：有机物、生长素、细胞分裂素、水、矿质元素、琼脂）；通过脱分化，形成愈伤组织（挑选出没有被污染的）；进行转接到分化培养基上，进行再分化（生长素浓度较高利于生根，细胞

8、分裂素浓度较高利于生芽）；一段时间后诱导出试管苗；移栽到大田。注意：整个过程要进行无菌操作图示如下：调控：生长素和细胞分裂素的比例植物体外植体（分化）愈伤组织（未分化）脱分化再分化根、芽（胚状体）特点：无定形状态、薄壁细胞、高度液泡化、排列疏松无规则营养条件：水、无机盐、蔗糖、氨基酸、维生素等激素：生长素类和细胞分裂素类温度： 无菌：条件光相关概念：愈伤组织：细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞,是一团没有特定结 构和功能并处于旺盛分裂状态的薄壁细胞。脱分化：由已分化的植物细胞形成愈伤组织的过程。再分化：愈伤组织生长一段时间后再移植到新的培养基（人教版：分化培养基）上继

9、续培养，重新诱导分化形成根、芽等器官的过程。培养基：固体培养基，含有矿质元素，碳源（蔗糖），氮源，植物激素，维生素(5)地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。细胞工程育种之一植物组织培养育种方法：离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽等器官植物体 原理：植物细胞的全能性 优点：快速繁殖、培育无病毒植株等 缺点：技术要求高、培养条件严格 实例：制备人工种子2.植物体细胞杂交技术（1）概念：就是将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。（2）、理论基础：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性。（3）、方法：去除细胞壁诱导原生质体

10、融合筛选杂种细胞组织培养 植物体（4）、过程A细胞B细胞纤维素酶和果胶酶A原生质体B原生质体原生质体融合再生壁杂种细胞植物体纤维素酶和果胶酶附：a原生质体：是指去除植物细胞壁后获得的裸露的植物细胞结构等。b诱导植物细胞融合的方法：物理法：离心、振动、电激等。化学法：一般用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（5）融合实质：原生质体的融合（6）完成标志：杂种细胞再生出细胞壁（7）意义：克服远源杂交不亲和的障碍。打破特种之间的生殖隔离，扩大遗传重组范围。细胞工程育种之二植物体细胞杂交育种方法：去掉细胞壁诱导原生质体融合组织培养 植物体 原理：植物细胞的全能性 （变异原理：染色体变异；融合原理：细胞膜具有

11、一定的流动性）优点：克服远源杂交不亲和的障碍，培育出作物新品种。缺点：技术复杂，不能按人们的需要表现出亲代的优良性状。实例：番茄马铃薯的培育【知识架构】杂种细胞AB的筛选 (三)植物细胞工程的应用：探究植物科学理论的重要手段，微型繁殖、培养脱毒苗、生产人工种子、培养新品种（单倍体育种）、转基因植物的培养，细胞产物的工厂化生产。1.植物繁殖a.微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。特点：不仅可以保持优良品种的遗传特性，还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。b.作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）植物分生区附近，如茎尖、根尖，由于细胞分裂快，很少被病

12、毒感染，甚至无病毒，因而被用来培育无病毒植株。c.人工种子：概念：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。（是指在植物组织培养中得到的体细胞胚状体，包埋在含有营养物质和保护物质的包被中，在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。也可用不定芽、顶芽和腋芽等为材料制作人工种子。）优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输2.作物新品种培育：单倍体育种和突变体的利用。I单倍体育种：a过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab四种类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养），得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素

13、处理，得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型）。b 优点：明显缩短育种年限，迅速获得纯系植株。II.突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）3.细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。细胞产物有蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱等。【总结】：植物组织培养和植物体细胞杂交的比较名称植物组织培养植物体细胞杂交原理细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性过程注意事项选材：选取根尖、茎尖、形成层部位、最容易诱导脱分化光照：脱分化过

14、程不需光照，再分化过程一定要有光去细胞壁的方法：酶解法，所用的酶是纤维素酶和果胶酶人工诱导融合的方法：物理法：离心、振动 电激化学法：用聚乙二醇诱导【答案和提示】2.1.1植物细胞工程的基本技术（一） 思考与探究1.为什么“番茄马铃薯”超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？提示：1978年，梅尔彻斯（Melchers）等人首次获得了马铃薯与番茄的属间体细胞杂种。他们将培育的二倍体马铃薯品系和番茄叶片细胞进行融合，所产生的杂交株被称为“马铃薯番茄”。像大多数杂种一样，杂交株同时具有马铃薯和番茄的形态特征。其中一些植株形成了“类似块茎的生殖根”，但是没有产生可结实的花、果

15、实以及真正意义上的块茎。到目前为止“马铃薯番茄”一类的体细胞杂交植物还不能产生经济效益，但是其研究价值不可忽视。至于马铃薯番茄没有像人们预想的那样地上长番茄、地下结马铃薯，主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。2.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体

16、实验方案。提示：根据眼虫的特点，动物细胞和植物细胞之间在理论上是可以实现杂交的。具体的实验方案可以设计如下：（二） 正文中讨论题【实验 胡萝卜的组织培养】1.在组织培养实验中，为什么要强调所用器械的灭菌和实验人员的无菌操作？提示：植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。造成培养基污染的因素有很多，一般包括：外植体带菌、培养瓶和各种器械灭菌不彻底、操作人员操作不

17、规范等。所以在组织培养实验中用到的植物材料和各种器械都要进行彻底地灭菌，实验人员操作一定要规范，避免带入杂菌。2.在本实验中，切取胡萝卜块根时强调要切取含有形成层部分，原因是这部分容易诱导形成愈伤组织。请思考一下，胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花），是否也能培养成小植株，你能用实验的方法进行验证吗？提示：胡萝卜的其他部分（如茎、叶、花）也能培养再生形成小植株，只是诱导愈伤组织比较困难。可以让学生参考利用胡萝卜根进行组织培养的实验，尝试设计出利用胡萝卜的茎、叶、花进行组织培养的实验流程。3.请根据上面的实验过程，概括出植物组织培养技术的流程简图。提示：见上图2.1.2植物细胞工程的实际应用（一）

18、思考与探究1.通过查阅资料，请你再列举出植物组织培养技术在我们生活中的另外一些应用。提示：a. 拯救濒危植物； b. 提供食品制作的原料； c. 利用愈伤组织进行转基因操作。2.请查阅植物人工种子制备技术的详细过程，设计出制备技术的主要流程图。提示：诱导植物愈伤组织体细胞胚的诱导体细胞胚的成熟体细胞胚的机械化包裹贮藏或种植3.请查阅相关文献，设计出一种植物花药组织培养和染色体加倍的实验流程。提示：花药花粉细胞培养愈伤组织分化出小植物单倍体植株正常植株（二） 正文中讨论题1.人们利用植物的微型繁殖技术来进行工厂化育苗生产，这是利用了该项技术的哪些特点？提示：植物“微型”繁殖技术具有高效性和可以保

19、持种苗的优良遗传特性的优势。工厂化大规模育苗生产正是利用了植物“微型”繁殖技术的这两方面优势。利用植物“微型”繁殖技术我们可以在短时间中获得大量的优质种苗。2.人工种子之所以神奇，是由于它具有天然种子不可比拟的特点，想一想它们具有哪些优点？提示：人工种子的优点：（1）天然种子由于在遗传上具有因减数分裂引起的重组现象，因而会造成某些遗传性状的改变；天然种子在生产上受季节限制，一般每年只繁殖12次，有些甚至十几年才繁殖一次。而人工种子则可以完全保持优良品种的遗传特性，生产上也不受季节的限制。（2）试管苗的大量贮藏和运输也是相当困难的。人工种子则克服了这些缺点，人工种子外层是起保护作用的薄膜，类似天

20、然种子的种皮，因此，可以很方便地贮藏和运输。3.人工种皮是保证包裹在其中的胚状体顺利生长成小植株的关键部分，请探讨人工种皮中应该具有的有效成分是什么？为了促进胚状体的生长发育，我们还可以向人工种皮中加入哪些物质？提示：针对植物种类和土壤等条件，在人工种子的包裹剂中还可以加入适量的养分、无机盐、有机碳源以及农药、抗生素、有益菌等。为了促进胚状体的生长发育，还可以向人工种皮中加入一些植物生长调节剂。4.高效抗癌的药物紫杉醇，虽然能造福人类，但却为濒危的红豆杉带来一场灭顶之灾。以“我们能否利用植物组织培养技术大量生产紫杉醇，从而拯救红豆杉”为题，与同学展开讨论，说出植物组织培养技术在节约资源、保护环

21、境方面的重要意义。提示：可以利用植物组织培养技术来大量生产紫杉醇。现在国内外的科学家们正在研究利用植物细胞培养技术来大量培育红豆杉细胞，希望利用这种方法来大量生产紫杉醇。国内外许多实验室开展了用组织培养法生产紫杉醇的研究，红豆杉属的11种植物现都在进行组织培养。ESC Agenetics公司宣布他们用细胞培养法所得紫杉醇的含量是树皮的25倍。国内外在分化细胞株系和培养条件方面做了不少工作，摸索了外植体、光照、培养基组成等因素对细胞培养及紫杉醇生成的影响。现在工艺条件已基本摸清，正研究反应的放大技术等，有望实现通过细胞培养进行工业化生产紫杉醇的目标。【知识拓展】1.什么是细胞全能性?细胞全能性（

22、cell totipotency）比较权威的定义是1984年国际组织培养协会做出的：“细胞全能性为细胞的某种特征，有这种能力的细胞保留形成有机体所有细胞类型的能力”。这个定义比一般所说的概念“一个细胞中包含着这种生物的全部遗传信息（基因），在适当的条件下可以发育成一个完整的生物体”更基本和全面。它不但包含了培养细胞再生成植株的情况（分化成各种类型的细胞，并以一定形式构建成植物），同时也包含了培养细胞生产次生代谢物的情况（不分化或只分化成某种类型细胞，但仍留着分化为其他细胞类型的能力）。前者成为组织培养和转基因植物需要进行植株再生的理论基础，后者成为像微生物发酵一样培养细胞，生产人们所需要的次生

23、代谢产物的理论基础，如通过红豆杉的细胞培养生产紫杉醇。2.植物组织培养技术是如何发展起来的？技术和理论是一对孪生兄弟，相辅相成，技术手段的发明会促进理论的创新，理论的创新又会指导技术的实践活动。植物组织培养也是如此。早在1902年，哈伯兰特（Haberlandt）提出高等植物的器官和组织可以不断地分割，直至单个细胞的观点，预言植物体细胞在适宜的条件下，有发育成完整植株的潜力，提出了植物细胞全能性的设想，并且用植物细胞组织进行了培养实验。他虽然未能获得再生植株，却是植物组织培养的开创者。1902年他发表了著名论文植物细胞离体培养实验，论文中提出的植物细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。从哈

24、伯兰特提出植物细胞全能性的理论，到1958年斯图尔德（F.C.Steward）等人第一次用胡萝卜根的韧皮部细胞证实了植物细胞的全能性，用了整整56年。56年中许多科学家做的事情归纳起来都是在探索哈伯兰特提出的“植物细胞在适宜条件下，有发育成完整植株的潜力”中的适宜条件。20世纪60年代以后，植物组织培养进入了迅速发展阶段，并逐步走向生产应用，如快繁脱毒、单倍体育种、种质资源保存、生产次生代谢产物等，也为人工种子、细胞融合、转基因植物等奠定了基础。3.怎样制备胡萝卜培养基（供参考）？（1）诱导胡萝卜愈伤组织在MS培养基注中加入质量分数为0.5 mg/L的6-BA和质量分数为0.5 mg/L的NA

25、A（2）诱导胡萝卜丛芽在MS培养基中加入质量分数为2 mg/L的KT和质量分数为0.2 mg/L的NAA（3）诱导胡萝卜生根在1/2MS培养基中加入质量分数为0.1 mg/L的NAA注：MS培养基的配制方法见选修1附录3中八。4.植物组织培养中的愈伤组织是如何形成及再分化的？植物组织培养中使用的外植体一般是高度分化了的细胞，在植物体中是不会再分裂繁殖的，只是执行某种功能直至死亡。这些细胞在培养基上培养时会由原来的分化状态，变成分生状态的细胞，分裂产生愈伤组织，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）过程。这种转变在细胞的形态结构和生理生化上都会产生一系列变化。组织培养的研究结果

26、表明分化细胞的脱分化需要两个条件，即创伤和外源激素。当细胞脱分化形成愈伤细胞后，经过一段时期的分裂，细胞群体变成不是一种细胞类型的均一群，又会产生分化，形成分生细胞或分生细胞团，由此再生成植株有两条途径：一是形成体细胞胚（功能类似于受精过程产生的胚），通过体细胞胚形成再生植株。二是走器官发生的途径再生植株，分生细胞在一定的诱导条件下重建芽的分生组织，分化出芽后再生根，成为完整的植株。5.为什么要在避光条件下培养愈伤组织？对于植物组织培养来说，光照条件非常重要，包括光照强度、时间和波长。但在愈伤组织的诱导阶段往往要暗培养，而在分化再生的过程中一定要有光照。愈伤组织诱导阶段的暗培养有利于细胞的脱分

27、化产生愈伤组织，如果在光照条件下容易分化产生维管等组织，不利于产生大量的愈伤组织。6.什么是人工种子？人工种子（artificial seed）是指通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外面包被着特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植物幼体。人工种子的概念中包含的“具有正常发育能力的材料”通常是指胚状体（目前国外有使用不定芽、顶芽和腋芽的），它可以由三种途径产生：（1）由已脱分化的外植体直接产生；（2）由愈伤组织产生；（3）由悬浮细胞培养产生。对胚状体的基本要求是：播种后能快速出苗；根和芽几乎同时生长，不产生愈伤组织；同步化程度高；活力强；形成的幼苗的形态与生长要正常。“外面

28、包被着特定的物质”是指人工种皮，制作人工种皮的材料有海藻酸钠、明胶、树脂、琼脂糖、淀粉等。对人工种皮的要求是：能保持胚状体的活力，有利于贮藏运输和萌发。选取的材料要有韧性，耐压，对胚状体无毒害，含有胚状体发芽所需要的营养成分或植物激素，还应含有杀菌剂，以防播种后微生物的侵害。人工种子目前还存在不少问题。例如，现有重要经济价值的植物产生胚状体能力弱，难以形成同步化的有强活力的胚状体；成本较高；运输贮藏以及机械化播种问题也未解决。因此，现在很少有人以生产为目的进行人工种子的研制。7.植物微型繁殖技术高效快速的实例有哪些？植物脱毒（virus-free）和离体快繁（in vitro propagat

29、ion）是目前植物组织培养应用最多、最有效的方面。生产上许多无性繁殖作物均受到病毒的侵染，从而导致品种的严重退化、减产和降低品质。利用植物分生组织进行培养可以使新长成的植株脱去病毒。利用这种方法生产无病毒苗的农作物有马铃薯、甘薯、大蒜、草莓、苹果、香蕉等，并已大规模应用于生产。离体快繁技术可以使一些植物的扩增速度比常规方法快数万倍乃至百万倍，而且产生的幼苗遗传背景均一，重复性好，不受季节和地区限制。目前世界上已建成很多年产百万苗木的组培工厂，成为一种新兴产业。离体快繁技术在观赏植物、园艺植物、经济林木和无性繁殖作物上已得到广泛应用。8微型繁殖与无性生殖微型繁殖是用于快速繁殖优良品种的植物组织培

30、养技术，实际上是无性生殖的一种。在繁殖的过程中，细胞进行有丝分裂，因此亲、子代细胞内DNA相同，具有相同的基因，因此能保证亲、子代遗传特性不变。利用这种技术能高效快速实现种苗的大量繁殖。9微型繁殖与作物脱毒、人工种子、单倍体育种作物脱毒、人工种子、单倍体育种的培育过程均有采用微型繁殖的技术。作物脱毒主要是强调微型繁殖的取材一定是无毒（的如茎尖、根尖），才能繁殖出无毒的幼苗。人工种子采用的还是微型繁殖的技术，但是只需培育得到胚状体、不定芽、顶芽和腋芽，包上人工种皮就可形成人工种子。人工种子与微型繁殖得到的幼苗一样能保持亲本的优良性状，另外还可不受气候、季节和地域的限制。单倍体育种的优点是后代无性

31、状分离，后代都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短育种年限。单倍体育种从本质上说属于有性生殖，这一点与微型繁殖有所区别。但单倍体育种首先要进行花药离体培养，采用还是微型繁殖的技术，然后用秋水仙素处理，获得纯合子。二、动物细胞工程 常用的技术手段：动物细胞培养，动物细胞核移植，动物细胞融合，生产单克隆抗体。其中动物细胞培养技术是基础技术（一） 动物细胞培养1、概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。这项技术是动物细胞工程的基础。用于培养的动物细胞和组织大多取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织。2、原理：细胞增殖3、动

32、物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。附：相关概念l 细胞贴壁：培养时悬液中分散的细胞很快就会贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。l 接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。l 原代培养：是指从供体获取组织或细胞后的初次培养。l 传代培养：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养。（一般情况下，传代培养10-50次后，细胞增殖会明显放缓，甚至完全停止，但有少

33、部分细胞克服细胞寿命的自然极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，即细胞内遗传物质发生了改变，细胞正在朝着等同于癌细胞的方向发展。）l 细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。l 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。4、动物细胞培养需要满足以下条件（1）无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。（2）

34、营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。合成培养基中通常需加入血清、血浆等天然成分。（3）温度：适宜温度：哺乳动物多是36.50.5；pH：7.27.4。（4）气体环境： 细胞培养所需气体主要是O2和CO2，O2 是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的PH。 进行细胞培养时，通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱中进行培养。附：培养基的的种类（按来源分）天然培养基：主要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，具有营养价值高、成分复杂的特点。合成培养基：是人工配制的，具有成分明确、便于控制实验条件的特点。5、动物细胞培

35、养技术的应用：（1）许多有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，都可以借助动物细胞的大规模培养来生产。 （2）作为基因工程的受体细胞。（3）用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。 （4）用于医学研究。 培养医学研究的各种细胞。植物组织培养与动物细胞培养的比较植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞的增殖培养基的物理性质固体液体（合成培养基）培养基的成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂、激素等葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等结果培育成新的植株或组织培育成细胞系或细胞株培养目的植株快速繁殖脱毒植株的培育人工种子生产药物、杀虫剂等转基因植物的培育蛋白质生物制品的

36、生产皮肤移植材料的培育检测有毒物质生理、病理、药理学研究取材植物幼嫩的部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织其他条件均为无菌操作，需要适宜的温度、pH、O2 等条件（二）动物体细胞核移植技术和克隆动物细胞核移植是一种利用显微操作技术将某种动物细胞的细胞核移入同种或异种动物的去除细胞核的成熟卵细胞内的技术。1、动物核移植概念：是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。（将供体体细胞的细胞核与受体去核卵细胞的细胞质进行人工组合，借助于卵细胞的发育能力，经过培养发育成胚胎，进而形成个体的技术。）（关键：

37、细胞核移植技术）克隆的含义：克隆（clone）是指通过无性生殖而产生的遗传上均一的生物群，即具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。（1）个体水平：在植物的无性增殖中，植物的发芽、插条等由同一个体通过无性生殖而增长的个体群均被视为克隆。采用组织培养方法可使植物细胞培养发育成完全的个体（愈伤组织），采用这种方法得到的具有相同基因型的个体群，也被称为克隆；在动物的无性增殖中，典型的例子是采用核移植实验方法，把分化细胞的核移植到一个事先去核的蛙卵中，让其发育并得到克隆蛙。克隆动物具有均一遗传性质，在研究环境条件对发育、分化的影响以及药物的检测

38、方面都是重要的实验材料。（2）细胞水平：由一个细胞经过有丝分裂生成的细胞群叫克隆。但如果培养细胞发生转化，则很容易引起染色体变异。（3）基因水平：利用基因重组操作技术，使特定的基因与载体结合，在细菌等宿主中进行增殖，有可能得到均匀的基因群。克隆是重组DNA技术的核心部分。事实上，克隆技术现已被人们用来通过营养方式繁殖病毒等微生物和植物的纯种，从而保证了这些生物基因组的准确连续性。细胞生物的克隆只需要营养培养基，而基因的克隆则需要某种载体复制子、特定的寄主细胞和营养培养基。选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达。

39、）在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。【特别提示】目前的实验证明，离体的植物体细胞的全能性得到了充分的体现（如植物组织培养），而离体的动物体细胞，其全能性受到限制，但其细胞核仍然保持全能性（如克隆技术培养动物个体），然而需要卵细胞质才能体现出来。2、种类：哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。3、体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞

40、，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。（见下图）克隆羊“多利”的产生过程4、体细胞核移植技术的应用：（1）在畜牧生产中，可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；（2）在保护濒危物种方面，可以增加这些动物的存活数量；（3）在医疗卫生领域：转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白；在治疗人类疾病时，转基因克隆动物细胞、组织

41、和器官可以作为异体移植的供体；人的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，形成相应的组织、器官后可以用于组织、器官的移植。（4）研究克隆动物和克隆细胞可使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程；（5）用克隆动物做疾病模型，能使人们更好的追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病的方法。5、体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。细胞工程育种之三动物细胞核移植育种方法：细胞核移植重组细胞培养成早期胚胎胚胎移植 原理：动物细胞核的全能性 优点：快速繁殖优良品种，保存濒危物种，有选择地繁殖某性别的动物。 缺点：导致生物品系减少，个体生存能力下降。 实例：“多利”羊等克隆动物的培育 附：现

42、代生物技术育种小结 类型 比较 基因工程育种细胞工程育种植物组织培养育种植物体细胞杂交育种动物细胞核移植育种原理基因重组植物细胞的全能性植物细胞的全能性（变异原理：染色体变异；融合原理：细胞膜具有一定的流动性）动物细胞核的全能性方法提取目的基因装入载体导入受体细胞基因表达筛选出符合要求的新品种离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体去掉细胞壁诱导原生质体融合组织培养细胞核移植重组细胞培养成早期胚胎胚胎移植优点目的性强，可以按照人们的意愿定向改造生物；育种周期短。快速繁殖、培育无病毒植株等克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出作物新品种。快速繁殖优良品种，保存濒危物种，有选择地繁殖某性别的动物。

43、缺点技术复杂，存在安全性问题。技术要求高、培养条件严格。技术复杂，不能按人们的需要表现出亲代的优良性状。导致生物品系减少，个体生存能力下降。举例抗软化番茄、转基因鲤鱼等。制备人工种子、试管苗的培育、培养转基因植物等。白菜甘蓝的培育、“番茄马铃薯”的培育。“多利”羊等克隆动物的培育。（三）动物细胞融合1、概念：指在一定条件下将2个或多个动物细胞融合为一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。诱导因素不同来源的细胞杂交细胞2、过程 附：诱导动物细胞融合的方法主要有物理法（如电激）、化学法（如聚乙二醇）、生物法（如灭活的病毒）3、意义：克服远源杂交的不亲和性

44、。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。4、动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合理论基础细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞增殖、细胞膜的流动性融合前处理酶解法去除细胞壁（纤维素酶、果胶酶）注射特定抗原，免疫处理正常小鼠诱导手段物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG）物理法:离心、振动、电激化学法：聚乙二醇生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）诱导过程第一步：原生质体的制备（酶解法）第二步：原生质体融合 （物、化法）第三步：杂种细胞的筛选和培养第四步：杂种植株的诱导与鉴定正常小鼠免疫处理动物细胞的融合（物、化、生法）杂交瘤细胞的筛

45、选与培养专一抗体检验阳性细胞培养单克隆抗体的提纯结果获取杂种植株获得杂种细胞，以生产细胞产品用途和意义克服远缘杂交的不亲和障碍，大大扩展杂交的亲本组合范围应用：白菜-甘蓝等杂种植株（1）制备单克隆抗体（2）诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症（四）单克隆抗体1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。概念：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。分布：主要分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液中。2、单克隆抗体的制备过程：对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应B细胞）；提取B淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使它们细胞融合注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选；在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体；然后对它进行克隆化培养和抗体检测筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。注入小鼠