2022年第三章细胞生物学研究方法总结.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 第三章 细胞生物学讨论方法第一节 细胞形状结构的观看方法辨论率：肉眼 0.2mm 光镜 0.2 m 电镜 0.2nm 一、光学显微镜技术（ light microscopy ）（一）一般复式光学显微镜技术a光学放大系统：目镜和物镜光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜,有时另加各种滤光片组成 机械和支架系统b辨论率 D：分开两个质点间的最小距离；伊红和美蓝： 特异结合061 其中： 为光源波长 蛋白质； 品红特异显示D 为物镜镜口张角 DNA 所在部位；Nsin /2 N 为介质折射率 c. 一般光镜样品制备：固定（如甲醛） 、包埋（如石蜡） 、

2、切片（约 5 m）、染色（二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位）1 FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术2 不同荧光素的激发光波长范畴不同,所以同一样品可以同时用两种以上荧光素标记；荧光显微镜中只有激发荧光可以成像；（三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ）1特点：瞬时只用很小一部分光照明,保证只有来自焦平面的光成像,成像清楚 辨论率比一般荧光显微镜提高 1.41.7 倍；通过转变焦平面位置可以观看较厚样品的内部构造,进行三维重构；2 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同

3、一小点；（四）相差和微分干涉显微镜技术 1相差显微镜（phase-contrast microscopy）光线通过不同密度物质产生相位差,相差显微镜将其变成振幅差；它与一般光镜的不同是其物镜后有一块“ 相差板”,夸大了不同密度造成的相位差；2微分干涉显微镜（differential interference microscopy ）用的是平面偏振光光经棱镜折射成两束,通过样品相邻部位,再经棱镜汇合, 使样品厚度上的微小差别转化为明暗区分,使样品产生很强的立体感；二、电子显微镜技术（electron microscope）（一）电子显微镜基本学问1与光镜的基本区分：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜

4、筒高真空、荧光屏等成像2辨论本事与有效放大倍数：辨论率 0.2nm,比肉眼放大 10 6 倍 有效放大倍数辨论本事指电镜处于正确状态下的辨论率；实际情形中,辨论率受样品限制；3电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等真空系统：用两级真空泵不断抽气记录系统：荧光屏或感光胶片成像（二）主要电镜制样技术介绍制样要求：要求样品很薄（数十纳米）要求保持精细结构1超薄切片技术固定：保持样品形状结构,甚至超微和分子水平上结构；固定剂：常用饿酸（OsO4）和戊二醛等,另外有物理方法如高频微波；名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 4 页精选学习资料

5、 - - - - - - - - - 脱水包埋：使样品中各种微小结构得到支撑,使切片连续完整并有足够强度；包埋剂常用环氧树脂；切片：厚度 40-50nm,通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来掌握；切片刀：玻璃或钻石刀,常用玻璃刀；切片置于覆有支持膜的载网上；染色：用重金属盐染色；如锇酸染脂肪、铅盐染蛋白质、醋酸铀染核酸等；通过电子束振幅的转变只能得到黑白图像；2负染色技术（negative staining ）仍可以与其他技术结合；用的是重金属盐,如磷钨酸或醋酸双氧铀,载网上铺上重金属盐,衬托出样品；3冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术 冷冻断裂：快速低温冷冻样品（液氮或液氦中）,然后样品在其结构相对脆

6、弱的部 位断裂；用另一些方法增强成效；冷冻蚀刻（ freeze etching）：主要用来观看膜断裂面的蛋白颗粒和膜表面结构,不需包埋也不需固定；冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching）4电镜三维重构技术 基本步骤：对生物样品在电镜中的不同倾角下拍照,得到的电镜图片再经变换处理 形成复合物三维结构的电子密度图；低温电镜技术、玻璃态、结构生物学；5扫描电镜技术（scanning electron microscope ,SEM ）主要用来观看样品表面的形貌特点,用CO 2临界点干燥法解决表面张力问题；扫描电镜景深长,成像具有剧烈的立体感；辨论本事可达 0.7nm ；

7、三、扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope ,STM ）利用量子力学中的隧道效应观测物质表面的形貌；主要装置： XYZ 三个方向扫描的压电陶瓷、靠近装置、电子学反馈掌握系统和数据采集、处理、显示系统；主要特点：原子原子尺度的高辨论本事,侧辨论率0.1-0.2nm,纵辨论率 0.001nm 可以在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量；其次节原子力显微镜（atomic force microscope ）等十余种扫描探针显微镜；细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分别细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心（ differential centrifug

8、ation ）：利用不同的离心速度所产生的不同离心力,将各种亚细胞组分和各种颗粒分开；密度梯度离心： 将要分别的组分铺放在含有密度逐步增加的、形成密度梯度的、高溶解性的、惰性物质溶液表面进行离心,形成不同的沉降带；二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法 利用显色剂与被检物质的特别基团反应显色来判定；DNA ：福尔根（ Feulgen）反应特异显示 DNA 分布；多糖： PAS 反应（即醛基与希夫 脂肪酸：四氧化饿（结果呈黑色）蛋白质：许多检测方法,如米伦（schiff 试剂反应呈紫红色）、苏丹（深红色） 、苏丹黑 Millon ）反应（红色沉淀） 、重氮反应、 “ SH”酶：大多数

9、固定剂对酶有钝化作用,定性讨论时,保持酶活性,与相宜底物温育；三、特异蛋白抗原的定位与定性 胞内蛋白定位：免疫荧光与免疫电镜 蛋白质体外分析定性：免疫印迹和放射免疫沉淀；名师归纳总结 （一）免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）第 2 页,共 4 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 定义：将免疫学方法与荧光标记技术相结合来讨论特异蛋白抗原在体内分布的方法；主要包括：荧光抗体的制备、标本的处理、免疫染色和观看记录等过程；一个概念：免疫酶标记技术（即以酶代替荧光素与抗体偶连）；（二）免疫电镜技术该技术同样用抗原抗体反应的

10、原理,能有效提高样品辨论率,在超微结构水平上研 究特异蛋白抗原的定位；免疫电镜技术可分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶技术与免疫胶体金技术 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性采纳原位杂交技术（in situ hybridization ）：用标记的核酸探针确定特别核苷酸序列；光镜下原位杂交：放射性同位素或荧光素标记探针 电镜下原位杂交：生物素标记探针,检测通过抗生物素抗体上的胶体金颗粒；五、利用放射性标记技术讨论生物大分子在细胞内的合成动态 1放射自显影技术：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用,对细胞内生 物大分子进行定性、定位与半定量讨论的一种细胞化学技术；2这一技术的独具特点：对细胞内生

11、物大分子的动态讨论和追踪（pulsechase）3两个主要步骤：同位素标记的生物大分子前体的掺入胞内同位素位置显示 4不同的放射性同位素及其挑选（P64）5显微放射自显影的基本步骤：标记（连续或脉冲）制片 敷 胶 （ 3 显微镜下观看10 m）曝光 显影和定影6电镜放射自显影技术：与显微自显影不同的是样品制备与敷胶的要求更为严格；六、定量细胞化学分析技术（一）显微分光光度测定技术（microspectrophotometry ）该技术利用细胞内某些物质或物质经染色后对特异光谱的吸取对其进行定量测定；包括：紫外光显微分光光度测定法和可见光显微分光光度法；以上方法各自的原理（P65）（二）流式细胞

12、仪（ flow cytometry ） P65 底 第三节 细胞培育、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培育（分原核生物细胞、真核单生物细胞、植物与动物细胞以及病毒的培育）（一）动物细胞培育1原代细胞（ primary culture cell ）：从有机体取出后立刻培育的细胞；传代细胞（ subculture cell ）：适应在体外培育条件下连续传代培育的细胞；2原代培育步骤：组织块胰酶或胶原酶与EDTA 良好的培育环境中（有小牛血清）转动培育3单层细胞培育：分散呈圆球形的细胞一经贴壁就快速铺展并开头有丝分裂,逐步形成细胞单层,成为单层细胞（single layer cell ）；4原代细胞

13、10 代4050 代无限制细胞株（ cell strain ）细胞系（ cell line ）几个出名的细胞系：Hela 细胞系、 BHK21 （baby hamster kidney ）细胞系、 CHO（chinese hamster ovary）细胞系；名师归纳总结 5体外培育细胞的形状：成纤维样细胞（fibroblast like cell ）、上皮样细胞epithelial like cell 6悬浮方法培育：某些传代细胞；这一方法的优点：同时获得大量细胞；（三）植物细胞培育（分单倍体细胞培育和原生质体培育）第 3 页,共 4 页单倍体细胞培育小孢子胚状体单倍体植株主要用花药愈伤组织诱

14、导分化出芽和根,最终长成植株；- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 原生质体培育：用纤维素酶去壁为原生质体,无菌培育、诱导分化为植株；用植物体细胞 不同植物原生质体融合,由此获得体细胞杂交的植株；（四）非细胞体系在细胞生物学讨论中的作用（P6768）非细胞体系：来源于细胞,而不具有完整的细胞结构,但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如功能系统和酶反应体系等）组成的体系；二、细胞工程（cell engineering ）主要技术：细胞培育、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等；（一）细胞融合与细胞杂交技术1细胞融合定义：两个或多个细胞融合成一个双核或多

15、核细胞的现象；2 动物细胞融合：灭活的病毒（如仙台病毒）或化学物质（如聚乙二醇）介导植物细胞融合：要先用纤维素酶除去纤维素壁；3电融合技术（ electrofusion method ）：低压沟通电场中集合,高压电脉冲下融合；4 同核融合细胞（homokaryon ）：基因型相同的细胞融合,同步有丝分裂产生有 大核的单核子细胞,称为融合核细胞（synkaryon ）；异核融合细胞（heterokaryon）：基因型不同的种内或种间细胞融合（二）单克隆抗体技术（monoclonal antibody ）1基本原理：将B 淋巴细胞和肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞,该细胞具有两种亲本细胞的特性,一方面可以

16、分泌抗体,另一方面可以无限增殖；2该技术的优点：可以用不纯的抗原分子制备纯一的单克隆抗体；由于产生特 异抗体的杂交瘤细胞株可以被分别；（三）细胞拆合与显微操作技术（P70-71）1 细胞拆合：把核和质分别开来,然后把不同来源的细胞质和细胞核相互协作,形 成核质杂交细胞；物理法：用机械方法去核或短波光把细胞核去掉或使之失活,然后用微 管吸取其他细胞的核,注入去核的细胞质中,组成新的杂交细胞；分类 化学法：用松胞素 B 处理细胞,使细胞排核,再离心将细胞分拆为核体 和胞质体两部分, 由于核体外包有一层细胞膜和少量胞质,因而在PEG 或仙台病毒的介导下,核体同另一胞质体融合,形成重组细 胞；2 纤维操作技术（micromanipulation ）即在显微镜下,用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射（microinjection ）的 技术；名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 4 页