2022年食品中总黄酮的测定 .pdf

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1、食品中总黄酮的测定（）目的意义黄酮类化合物（ flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。 其分析方法有多种， 对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析， 常采用高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography ，HPLC） ； 而对于总黄酮含量的测定， 则主要采用分光光度法。 通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。（二）高效液相色谱法1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm 条件下，以保留时间定性、峰面积定量。2仪器和试剂（1）高效液

2、相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯） 。（10）去离子水（11）芦丁标准溶液：精确称取经105干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至 100ml，配成 150ugml 的芦丁标准溶液。3. 操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取 2.0g 干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（6090）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇 50ml 和 25HC1 5ml，80水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温

3、，转移至 50ml 容量瓶中，甲醇定容，经0.45um 滤膜过滤，供分析用。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - 2） 液体样品：准确吸取样品 2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂， 挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。（2）色谱分离条件色谱柱： CLCODS，6mm150mm，5um; 流动相： 0.3磷酸水溶液：甲醇（ V:V）40:80，临用前用超声波脱气；流速：lmlmin；柱

4、温：40；检测波长： 360nm；灵敏度： 0.02AUFS；进样量： 20ul。（3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。4结果计算（三）分光光度法1原理黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有 4 位羰基，且呈现黄色。 黄酮类化合物的 3羟基、4羟基或 5羟基、4羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 -

5、- - - - - - 第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - 本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm 波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。2仪器和试剂（1）722分光光度计（2）索氏提取器（3）真空泵，盐基交换管等。（4）恒温水浴，分液漏斗。（5）芦丁标准品（6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。（7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯） 。（8）5香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。（9）聚酰胺树脂（10）去离子水（11）同前3操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取12g 干燥的固体样品

6、，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入 50100ml 70乙醇溶液浸润后，在80水浴下回流 3h，至提取液无色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在 50下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶液，用30ml 热水分 3 次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以 75ml 氯仿分 3 次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。称取 12g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱， 用水饱和。 吸取上述脱脂后的水溶液12ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用 70乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0m

7、lmin，至流出液基本无色，一般收集 10ml 即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。2）液体样品：准确吸取1.0ml 样品，定容至 50ml 后，直接以 75ml 氯仿分3 次萃取脱脂，其余步骤同上。（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - 00ml（相当于芦丁 0、75、150、300、450、600ug） ，移入 10ml 刻

8、度比色管中，加入 30乙醇溶液至 5ml，各加 5亚硝酸钠溶液 0.3ml，振摇后放置 5min，加入 10硝酸铝溶液 0.3ml 摇匀后放置 6min，加 1.0molL 氢氧化钠溶液 2ml，用30乙醇定容至刻度。摇匀， 放置 15min，于 510nm 波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（ r） 。（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm 处进行吸光度的测定 （样液如有沉淀， 应过滤后测定）。4.结果计算根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量：（四）说明1HPLC 法与分光光度法比较， HPLC 法相对干扰少，重现性好，测定结果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。2样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此样品水解后应尽快测定。3. 随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 4 页 - - - - - - - - -