2022年铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中表达及其性质研究报告.docx

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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 个人资料整理 仅限学习使用铜绿假单胞菌 algL 基因在毕赤酵母中的表达及其性质争论岳 明,丁宏标,乔 宇中国农业科学院饲料争论所生态饲料争论室,北京 100081）摘要： 【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其性质加以争论；【方法】采纳 PCR 的方法,以铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ）基因组 DNA 为模板,克隆出约 1.0kb 的海藻酸裂解酶基因 algL 的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母 Pichia pastoris）表达载体 pPIC9K中,获得重组质粒 pPIC

2、9K- algL；重组质粒线性化后用聚乙二醇 in Pichia pastoris and Characterizationof the EnzymeYUE Ming, DING Hong-biao, QIAO YuFeed Research Institute, ChineseAcademy of Agricultural Sciences, Beijing 100081 Abstract: 【 Objective】The purpose was to clone and express alginate lyase genealgL of Pseudomonas aeruginosa in

3、 Pichia pastoris expression system. 【Method 】Alginate lyase gene of P. aeruginosawas amplified and inserted into pPIC9K expression vector by adding EcoR I site to generate recombinant pPIC9K- algL construct. The positive construct was transformed to Pichia pastoris GS115 cells by PEG method. The Alg

4、L protein was over-produced in P. pastoris induced by methanol. 【 Result】 The product of recombinant alginate lyase showed a molecular weight of 40 kD on SDS-PAGE with activity of 540U ml-1 at an optimal temperature 40 and pH 8.5, respectively. The recombinant AlgL was stable below 45 between pH3.0

5、and 12.0. The recombinant AlgL was sensitive to some metal cations negatively including Zn 2+, Cu 2+ and Fe 2+, but Co 2+ and Ca 2+ promoted it dramatically. The sterilization of ampicilin and kanamycin on P. aeruginosa increased with the help of AlgL. 【 Conclusion 】P. pastoris expression system is

6、an efficient way of production of AlgL. The recombinant AlgL has potency as feed additive and antibiotic assistant.Key words: Alginate lyase； Pichia pastoris ； Alga oligosaccharides； Induction expression 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 7 页精选学习资料 - - - - - - - - - 0 引言个人资料整理仅限学习使用1.1.1菌株和质粒 铜绿假单胞菌P. aeru

7、ginosa ）,购【争论意义】海藻酸盐alginate ）是广泛存在于自中国科学院微生物争论所菌种保藏中心CGMCC 大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖；它的 存在对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗养分因 子,影响了海藻细胞内养分物质的释放,降低了饲料 利用率；另外,海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌1.1785 ）；大肠杆菌E. coli ） DH5菌株由本室保存；毕赤酵母P. Pastoris ）GS115 和 pPIC9K 分泌型表达载体购自Invitrogen 公司；质粒pGEM-T Vector购自 Promega 公司；Pseudomonas aeruginosa ）在病灶部

8、位定殖1,2 ,影1.1.2酶和试剂 限制性内切酶、T4 DNA 、X-Gal 连接响抗生素的扩散和杀菌成效,使铜绿假单胞菌具有较高的抗药性3,4 ；铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生酶为TaKaRa 公司产品；DNA聚合酶购自Tiangen理后期能产生一种海藻酸盐裂解酶alginate lyase,公司；G418 购自 Invitrogen公司；海藻酸钠、葡萄AlgL ）,可催化海藻酸盐 -D-甘露糖醛酸单体间 1,4- 糖苷键断裂,生成寡聚糖醛酸 5,6 ,降低细菌的黏糖醛酸为 Sigma 公司产品；氨苄青霉素和卡那霉素为Amresco 产品；其它化学试剂为国产和进口分析附才能,从而终止其生命

9、周期；海藻饲料中的海藻酸 盐经海藻酸裂解酶降解后,胞内的养分物可被充分质 释放出来,利于动物消化吸取,所产生的海藻寡糖仍 具有改善动物胃肠道微生态环境等活性；因此,海藻 酸裂解酶的生产争论对饲料资源与医药开发具有肯定 的理论与现实意义；【前人争论进展】一些微生物纯试剂；1.1.3培育基LB 培育基见文献23 , YPD 、RDB 、MM 、MD 、BMGY 、BMMY培育基见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册；1.2 试验方法79 和海洋动植物1013 都可以产生海藻酸裂解酶,早1.2.1铜绿假单胞菌algL 基因成熟蛋白编码序列的期海藻酸裂解酶主要由自然菌株培育提取5,14 ；随着基因

10、工程技术的进展,一些物种海藻酸裂解酶基因被 克隆和表达 1517 ； Boyd 等 18 和 Neal 等 19 先后于克隆 参照文献 23 方法从铜绿假单胞菌中提取基因组1993 年首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编 DNA ；依据 GenBank No. U27829 序列 18,以 algL 基码基因 algL 并在大肠杆菌 Escherichia coli ）中进行 因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密码了表达,证明白它与其它海藻酸代谢相关基因 algD-子序列 1023 bp）设计 PCR 扩增引物,上游引物序8-44-K-E-G-X-L-I-J-F-A ）位 于 染色

11、体 上 同一 基 因簇 中,在海藻酸代谢过程中起重要作用 20 ；【本争论列 为 5 CGAATTCGCCGACCT GGTACCCCCGCCCGGCTACTA 3 ,下游引物序列切入点】原始菌株产酶量特别有限,提取纯化成本高为5 昂,而在大肠杆菌中表达海藻酸裂解酶基因,易受原CGAATTCGCCCGCTTCCCGCCACGCCCTCAACTT核表达系统自身局限性的限制,影响产量与活性；巴 C 3,其中上、下游引物中都引入 EcoR 限制性酶斯德毕赤酵母 Pichia pastoris ）作为一种分泌型真核 切位点 如下划线所示）；以铜绿假单胞菌基因组表达系统,表达水平高,纯化过程简洁,生产成

12、本低 21,22 ,可作为一种高效生产海藻酸裂解酶的手段；【拟解决的关键问题】本争论利用基因工程技术克隆DNA 为模板,进行 PCR 反应,体系为 50 l：含有约50ng 铜 绿 假 单 胞 菌 基 因 组 DNA 1.5 l, 总 浓 度10mmol L-1 dNTP 4 l,10mmol L-1 的上下游引物各了铜绿假单胞菌 algL 基因,将其导入巴斯德毕赤酵 1 l,10 PCR 反应缓冲液 5 l,5U l-1pfu DNA 聚合母并进行诱导表达,旨在获得一种高效生产海藻酸裂 酶 0.5 l, ddH 2O 37 l；反应条件为：94预变性解酶的新途径,进而对表达产物性质以及作为抗

13、生素 5min 后, 94变性 50s,58退火 50s, 72延长帮助剂的作用成效进行探究；1min ,进行 30 个循环,最终延长 5min,反应终止后1 材料与方法 1.1 试验材料加入 Taq DNA 聚合酶与 dATP 72反应 20 min ,以使平末端带有成为 A 突出的黏性末端；名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 7 页精选学习资料 - - - - - - - - - 个人资料整理 仅限学习使用PCR 扩增产物经胶回收纯化后,连接到 pGEM-T Vector 上,转化大肠杆菌 DH5,通过蓝白斑挑选获得阳性克隆,并进行测序鉴定；产酶菌株重新接种于 50ml

14、 培育基中用于性质争论和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 24 ；采纳 3 , 5-二硝基水杨酸法测定酶活力 25 ；每名师归纳总结 1.2.2毕赤酵母重组表达载体的构建鉴定正确的24h 取甲醇诱导的产酶菌株酶液100 l与 100 l 1%褐藻酸钠溶液 pH7. 0 的 1/15N 的磷酸缓冲液配制）于pGEM- algL 经 EcoR酶切处理,将切下的algL 基因试管中混匀,同时以100 l 蒸馏水替代酶液做空白对比试验；置于40水浴反应10 min ,冷却,加入成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达载体pPIC9K 中,使其位于- 因子信号肽序列的下3,5-二硝基水杨酸显色剂60

15、0 l,再沸水浴10min 显游,利用PCR 鉴定出正向插入的克隆,并对该质粒色,冷却,用蒸馏水定容至5 ml ,混匀,在550nm进行进一步限制性酶切及测序鉴定；下测定吸光度用空白调零）,OD 值越高酶活力越1.2.3毕赤酵母的聚乙二醇PEG ）法转化 接毕赤酵高；酶活力定义：在肯定温度和pH 值下,每分钟催化海藻酸钠水解生成1 g葡糖醛酸的酶量定义为一个母菌株GS115 单菌落于10ml YPD 中 30, 250海藻酸裂解酶活力单位U）；300r/min 培育至OD600为 0.61.0,离心收集菌体,1.2.6重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳固性测定用 10 ml Solution 见

16、 Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册）重悬细胞,离心收集菌体,用1 ml Solution 表达产物经Millipore离心过滤脱盐后,在40不同重悬细胞,此时酵母细胞处于感受态,取80 l 上述pH 条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力；将重组海菌液,加入3 g经限制性内切酶Bgl线性化的重组藻酸裂解酶液在不同pH 值的缓冲液中40保温质粒pPIC9K- algL ,加入1 ml Solution ,充分混30min ,检测剩余的酶活力以最适反应pH 下酶活力匀, 30水浴1h,其中每15min 旋涡震荡, 42水为 100%）；浴10min , 4000r/min离 心 收 集 菌 体

17、 , 加 入1 ml 将表达产物在pH8.0 不同温度下测定重组海藻酸Solution , 离 心 去 上 清 , 最 后 加 入100 150 l 裂解酶的酶活力；将重组海藻酸裂解酶液在pH8.0 不同温度下分别保温30min ,检测剩余的酶活力以最Solution ,重悬细胞,菌液涂布于固体RDB 平板适反应温度下酶活力为100% ）；上, 30培育 24 d 直至转化子显现；1.2.4重组毕赤酵母的挑选和鉴定用灭菌牙签挑取配制0.1mol L-1的 CoCl 26H2O、 MnSO 4H 2O 、CaCl 2、 KCl 、NaCl 、 CuSO4、 FeSO47H2O、 ZnCl 2、R

18、DB 平板上的转化子分别点种到 MM 、 MD600 g-1 G418 的 YPD 平板上, 30培育；在和含 MDMgSO 4溶液,将酶液与上述溶液混合使终浓度分别为 1、10 和 50 mmol L-1）后在40保温 30min ,测定酶活力,以未与盐溶液混合,在40 保温30min上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化子为甲醇利用慢型；在含G418 的 YPD 平板上生长正的酶液活力为100% ；常的为多拷贝转化子；1.2.7重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与对铜毕赤酵母基因组DNA的提取参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册；以毕赤酵母基因组DNA为模绿假单胞菌耐药性的影响

19、将 1ml 1%的海藻酸钠底物板,利用目的基因特异性引物序列见1.2.1）进行PCR 反应,以确定外源基因的整合情形；与 500l 酶液混和,在40下保温6 h,使之充分反应；将反应混和物煮沸灭活后,在绽开剂正丁醇1.2.5重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将转甲酸 水4 6 1）中进行薄层层析,凉干后,均化子接种于含3ml BMGY培育基中的12ml 离心管匀喷上显色剂甲醇 硫酸4 1 ）, 100显色5 中, 30 220r/min 摇床培育48h；离心收集菌体,用min ；3ml BMMY诱导培育基重悬菌体,30220r/min继将重组酶、抗生素分别或混和使抗生素终浓度相同）点于铜绿假

20、单胞菌生长平板含 OD 6000.6 菌液续培育,每24h 补加甲醇至终浓度1.0%；每 24h 取样,将培育液于6000r/min离心5min ,收集上清酶100l）上,对比氨苄青霉素和卡那霉素的抑菌成效液,用于初步定性测定酶活力,以确定产酶菌株；将变化26；第 3 页,共 7 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 个人资料整理 仅限学习使用2 结果与分析2.1铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克隆及毕赤酵母表达载体的构建以铜绿假单胞菌基因组 DNA 为模板,扩增出1.0kb 左右的 algL 基因成熟蛋白编码序列,插入到毕赤酵母表达载体 pP

21、IC9K 中后,测序结果说明插入片段在 pPIC9K 中有正确的阅读框,表达载体 pPIC9K-algL 构建胜利；2.2 重组毕赤酵母的挑选和鉴定通过在MM和 MD 培育基上的培育,得到的转-1 ml图 2 重组毕赤酵母诱导产酶曲线化子大部分为甲醇利用慢型,并在含有600 gFig.2 Curve of recombinantAlgL activity produced by P. pastorisG418 的 YPD 平板上获得了多个高拷贝转化子；提取重组工程菌菌株基因组 DNA ,进行 PCR 鉴定,结果说明 algL 基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的基因组中 图 1）,保证了基因

22、的稳固遗传；2.3 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将初筛有酶活的菌株在诱导培育基中进行表达,每 24h 测酶活力,挑选出一株酶活力最高的毕赤酵母重组工程菌,酶的活力在诱导培育 120144h 达到高峰图 2）,峰值为 540U ml-1左右； SDS-PAGE 分析结果说明 图 3）,表达产物分子量约为 40kD ；2.4 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳固性测定在不同 pH 反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力,测得该酶最适 pH 为 8.5 左右,并在 pH4.0 12.0 的条件下仍具有 60%以上的酶活力；将重组海藻1-6. 甲醇诱导 24, 48, 72, 96, 120和 1

23、44 小时重组 AlgL 产物； 7. 蛋白质 分子量标准； 8. 诱导前上清液 1-6. RecombinantAlgL induced within 24, 48, 72, 96, 120, 144h by methanol； 7. Standard protein molecular weight； 8. Supernatant before induction酸裂 图 3 不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量 Fig.3 SDS-PAGE of expressed AlgL within different induction times1.重组酵母基因组PCR 扩增产物； 2. DL2

24、000 分子量标准； 3. 原始酵母解酶在不同pH 的磷酸缓冲液中40保温 30min ,检测剩余的酶活力,发觉该酶在pH3.0 12.0 的条件下保温 30min 后仍剩余60%以上的酶活力图 4）；菌株 GS115基因组 PCR扩增产物1.PCR product of recombinant P. pastoris； 2. DL2000 marker product of P. pastoris GS115； 3. PCR 图 1 重组毕赤酵母工程菌株的PCR鉴定Fig.1 Identifation of recombinant P. pastoris by PCR名师归纳总结 - - -

25、 - - - -第 4 页,共 7 页精选学习资料 - - - - - - - - - 图 4 pH 对重组酶活力的影响及pH稳固性个人资料整理仅限学习使用Fig.4 Optimum pH and pH stability of the recombinant AlgL在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力,发 现该酶最适反应温度为 40；将重组海藻酸裂解酶的酶液分别在不同温度下保温 30min ,检测剩余的酶 活力,结果说明重组海藻酸裂解酶在 2045的条件下保温 30min 后仍具有 75%以上的酶活力,而在50 及 以 上 条 件 下 保 温 30min 酶 活 下 降 明 显 图 5）

26、；图 6 金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响Fig.6 Effect of metallic ions on recombinant AlgL activity2.5 重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单胞 菌耐药性的影响海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解,可产生多种 寡糖,其中包括单糖及其它一系列寡糖 图 7）,由于单糖和其它寡糖的同时产生说明该酶具有外切和内 切活性；图 5 温度对重组酶活力的影响和热稳固性Fig.5Optimum temperature and thermolstability of recombinant AlgL由图 6 可见,离子浓度为1、10 和 50 mmol

27、 L-11. 葡萄糖醛酸； 2, 3. 重组酶降解海藻酸钠产物 1. Glucuronic acid ； 2, 3. Poduction catalyzed by recombinant AlgL的盐溶液对酶活力的影响有明显差异：50mmol L-1的Mn2+、Mg2+、Co2+、 Ca2+、 K+和 Na+对酶活力均有不同程度的促进作用,而在1 和 10mmol L-1浓度下作图 7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析用不明显,其中50mmol L-1的 Co2+和 Ca2+可将酶活力提高50%以上； Zn2+、Cu2+和 Fe 2+对酶活力均有抑制作用,而且浓度越高越明显,其中50mmol

28、 L-1的Fig.7 TLC of production catalyzed by recombinant AlgLCu2+与 Fe 2+分别使酶活力丢失了近80%和 60%；在铜绿假单胞菌生长平板上,依据抑菌圈直径大 小,终浓度分别为 20 mg ml-1和 2 mg ml-1的氨苄青霉素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌成效分别提名师归纳总结 高 29%和 18%,纯酶液不产生抑菌圈:3979-3985.争论,发觉该酶的最适反应温度为40,最适pH 为2 Mark T A, Neal L S. Alginate lyase AlgL activity is required for 8.5

29、左右,均高于Alfred报道5,可能与毕赤酵母表alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. Journal of 达产物的糖基化有关,并且保证了该重组酶在较宽的 pH 范畴下具较高活性和稳固性；本争论中抗生素在 重组海藻酸裂解酶帮助作用下,抑菌成效明显提高,Bacteriology, 2005, 18711: 3869-3872.3 Boyd A , Chakrabarty A M. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa. Applied an

30、d Environmental 这与 Richard 等使用自然酶所得到的结果相近26 ,说Microbiology , 1994, 607: 2355-2359.明重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保4 Jain S, Ohman D E. Role of an alginate lyase for alginate transport in 护层,使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用,降mucoid Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunity, 2005, 低了细菌的抗药性与药物施用剂量；5 7310: 6429-6436.不同生物

31、来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一Alfred L, Leigh R E. Isolation and characterization of an alginase 性,本试验以多聚甘露糖醛酸: 958-964.名师归纳总结 - - - - - - -第 6 页,共 7 页精选学习资料 - - - - - - - - - 6 Monday S R, Schiller N L. Alginate synthesis in Pseudomonas 个人资料整理仅限学习使用algL: Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli.

32、aeruginosa: the role of AlgL alginate lyase and AlgX. Journal of Bacteriology, 1996, 1783: 625-632.Journal of Bacteriology , 1993, 17515: 4780-4789.19 Boyd A, Ghosh M, May T B, Shinaberger D, Koegh R, Chakrabarty A 7 Helga E, Frode E, Gudmund S, Bernd H A R, Svein V. Biochemical M. Sequence of the a

33、lgLgene of Pseudomonas aeruginosa and properties and substrate specificities of a recombinantly produced Azotobacter vinelandii alginate lyase. Journal of Bacteriology, 1998, purification of its alginate lyase product. Gene, 1993, 131: 1-8.20 Antonette R P, Wong T Y , Sletta H, Svein V , Schiller N

34、L. AlgX Is a 8 18015: 3779-3784.periplasmic protein required for alginate biosynthesis in Pseudomonas Tomoo S, Miwa O, Yoshio E. Novel alginate lyases from marine aeruginosa. Journal of Bacteriology , 2004, 18621: 7369-7377.9 bacterium Alteromonas sp. strain H-4. Carbohydrate Research, 1997, 21 Gurk

35、an C, Ellar D J. Recombinant production of bacterial toxins and 304: 69-76.their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Zhang Z Q, Yu G L, Guan H S, Zhao X, Du Y G, Jiang X L. Microbial Cell Factories , 2005, 4:33. Preparation and structure elucidation of alginate oligosaccharides

36、degraded by alginate lyase from Vibro sp.510. Carbohydrate Research, 22 Macauley P S, Fazenda M L, McNeil B, Harvey L M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast, 2004,339: 1475-1481. 2005,22: 249-270.10 Shimizu E, Ojima T, Nishita K. cDNA cloning of an algi

37、nate lyase 23 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆试验指南 第 3 版. 北京 : 科from abalone, Haliotis discus hannai . Carbohydrate Research, 2003, 学出版社 , 2002: 1949.338: 2841-2852. Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning : A Laboratory Manual 11 Favorov V, Vozhova E, Denisenko V, Elyakova L. A study of reaction 3rd ed. Beijing: Science Press, 2002: 1949. in Chinesecatalysed by alginate lyase VI from the