翻译好的-罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书.doc
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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date翻译好的-罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、 原理:TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞
2、核DNA的断裂情况。其原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端,并与连接辣根过氧化酶(HRP,horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合,后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡
3、原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价,以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、 器材与试剂器材:光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒(塑料饭盒与纱布)、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等;试剂:试剂盒含:1号(蓝盖)Enzyme Solution 酶溶液:TdT 10、 2号(紫盖)Label Solution标记液:荧光素标记的dUTP 1、 3号(棕瓶)Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP;自备试剂:PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)、DAB工作液(临用前配制,5 l 20DAB+1L 30%H2O2+94 l P
4、BS)、Proteinase K工作液(10-20 g/ml in 10 mM Tris/HCl,pH 7.4-8)或细胞通透液(0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠,临用前配制)、苏木素或甲基绿、DNase 1(3000 U/ml 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl,pH 7.5, 10 mM MgCl2,1 mg/ml BSA)等。三、 实验步骤操作流程图:制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透加TUNEL反应液加converter-POD与底物DAB反应显色光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤(石蜡包埋切片的检测):1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min;2. 用
5、梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min;注:上面两步是针对石蜡切片样本的处理4. 用Proteinase K工作液处理组织15-30 min 在2137C(温度、时间、浓度均需摸索)如果凋亡细胞染色较弱时,可用高浓度的Proteinase K(400g/mL)处理5 分钟。其它替代方法: 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一,即蛋白酶K 处理的步聚改用下述方法,其余步聚均相同:替代方法 1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min(通透液:0.1%TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠,需新鲜配制)替代方法 2: 将脱蜡及水合
6、好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min(胃蛋白酶:0.25%-0.5%溶于HCl PH2,胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl )替代方法 3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M 的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中,置于微波炉中350W(低档)处理5 min。5. PBS漂洗2次;6. 制备TUNEL反应混合液:处理组用50l 1号液+450l 2号液混匀;而阴性对照组仅加50l 2号液,阳性对照组先加入100l DNase 1,反应在152510min,后面步骤同处理组。7. 玻片干后,加50l TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50l 2号液)于标本
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