茚三酮比色法-氨基酸含量的测定.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date茚三酮比色法-氨基酸含量的测定茚三酮比色法-氨基酸含量的测定茚三酮显色法测定氨基酸含量原理茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。 试剂与材料1.标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液。2.pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86m

2、L 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。3.茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于1525mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌

3、15min，然后在冰箱内冷却到4，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡12h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121125的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。4.60乙醇。5.样品液：每毫升含0.550g氨基酸。6.分光光度计。7.水浴锅。操作步骤1标准曲线的制作分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，

4、在100水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。2氨基酸样品的测定取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。结果计算氨基酸含量（mmol/L）=OD570nm 1 000OD对应标准曲线查得值。-