生化实验讲义(10个).doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date生化实验讲义2010(10个)生 物 化 学 实 验 讲 义生 物 化 学 实 验 讲 义赵国芬2010年9月实验之前说明1. 各班学习委员将成员分成10个大组,每个大组中2人一小组,大组采用循环实验的方法,同时开出不同的10个实验.2. 共开出10个不同的实验实验一 温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响实验二 牛奶中蛋白质的提取与鉴定实验三 血液葡萄糖的测定

2、-福林（Folin）-吴宪氏法实验四 双缩脲测定蛋白质的含量实验五 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳实验六 植物组织中还原糖和总糖的含量测定实验七 应用纸层析法鉴定动物组织中转氨基作用实验八 植物组织中维生素C的定量测定实验九 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察实验十 植物组织中DNA的提取和鉴定3. 穿着要利索,做好实验记录4. 注意实验室卫生和安全.一. 实验室规则:按照实验室的规则给学生讲解.二. 生物化学所用的实验技术1. 样品: 动物样品:血液、血浆、血清、组织 植物样品：果实、花蕾、茎等无论用什么做材料，为了提取物质，需匀浆2移液管的使用：移液 管吸管移液管奥氏吸管读数时视线与凹面相

3、平，取液时要用吸管嘴吸，放出液体时注意嘴部液体的残留问题。3离心机的使用：平衡（管平衡、机器平衡）缓起和慢停4分光光度计机器原理和测定原理（比尔定律）5水浴锅的使用三、实验报告的书写（用教务处统一印刷的报告纸写）目的、原理、仪器、药品、步骤、结果及结论、讨论实验一、温度、pH及酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响一、实验目的通过本实验了解酶催化的特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对酶活力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其调控机理具有十分重要的意义。二、实验原理 酶的化学本质是蛋白质。凡是能够引起蛋白质变性的因素，都可以使酶丧失活性。此外，温度、pH和抑制剂、激活剂对酶的活性都有显著的影响。酶的活

4、性通常是用测定酶作用底物在酶作用前后的变化来进行观察的。 本实验用唾液淀粉酶作用的底物淀粉，被唾液淀粉酶分解成各种糊精、麦芽糖等水解产物的变化来观察该酶在各种环境条件下的活性。 淀粉被酶水解的变化，可以用遇碘呈不同颜色来观察。淀粉遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色;最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色反应。 三、试剂1.0.5%淀粉溶液 2.碘化钾碘溶液 3.1%尿素溶液。4.1%CuSO4溶液 5.磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液pH5.0-8.0:6.0.5%NaCl溶液。7.唾液淀粉酶制备 每人用自来水漱口3次，然后取20m1蒸馏水含于口中，半分钟后吐入烧杯中，纱布

5、过滤，取滤液lOml，稀释至2Oml为稀释唾液，供实验用。四、操作步骤一、温度对酶活性的影响（一） 淀粉酶的观察1、 取3支大试管，编号后按表操作试管号0.5%淀粉溶液稀释酶液温度1235ml5ml5ml1ml1ml1ml0水浴37水浴沸水浴2、在白色比色板上，置碘液2滴于各孔中，每隔1分钟，从第二管中取出反应液1滴与碘混合，观察颜色变化。3、待第二管中反应液遇碘不发生颜色变化（即只呈碘的颜色）时，向各管中加入碘液1滴，摇匀，观察并记录各管颜色，说明温度对酶活性的影响。结果与分析：结果：各管颜色分析：为什么比如：结果与分析：1号中为兰色，2号为无色，3号为兰色说明37为淀粉酶的活性最高的温度，

6、淀粉水解的速度最快，其它2个温度淀粉酶的活性低，淀粉几乎没有水解。二、pH对酶活性的影响 1、取试管1支，加入pH6.8的磷酸缓冲溶液3m1、0.5%淀粉溶液2ml，混匀。放置于37水浴中保温3分钟。再加入稀释唾液2ml，混匀，继续保温，每隔l分钟取出1滴于白瓷板上，加碘液1滴，观察淀粉水解的程度，直至碘不变色，记下保温时间。 2、另取试管5支，编号，按编号顺序分别加入pH5.0、 6.2、6.8、7.4、8.0的磷酸盐柠檬酸缓冲溶液3m1，每管加入0.2%淀粉溶液2m1。置37水浴中保温3分钟后，以1分钟的间隔，依次向1-5号试管中加入稀释唾液2m1，摇匀，37水浴中保温。参照上述第一步实验

7、的保温时间，到时迅速取出，并立即加入碘液2滴，充分摇匀，观察各管呈现的颜色，判断在不同pH条件下淀粉的水解的程度。可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定最适pH。结果与分析：结果：各管颜色分析：为什么三、酶的激活剂、抑制剂对酶活性的影响1. 取小试管3支，按表操作 试管号0.5%淀粉溶液1%CuSO4溶液0.5%NaCl溶液蒸馏水稀释唾液结果1232ml2ml2ml1 ml0001ml0001ml1 ml1 ml1 ml分析2. 将3支试管放入37水浴中，并在白色比色板上用碘液检查第二管，待碘液不变色时，向各管中加碘液1滴，观察水解情况，记录并解释结果。结果与分析：结果：各管颜色分析：为什

8、么四酶的高效性试管号H2O2生马铃薯熟马铃薯铁粉结果12343ml3ml3ml3ml少许000少许000少许分析实验二 牛奶中蛋白质的提取与鉴定一、实验目的 学习从牛奶中制备酪蛋白的方法并进行鉴定试验二、实验原理 牛乳和羊乳中含丰富的蛋白质，其中主要是酪蛋白。酪蛋白在其等电点pH溶液中溶解度降低。所以，将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白。所得酪蛋白供定性鉴定。 除去酪蛋白的滤液中，尚含有球蛋白、清蛋白等多种蛋白质。三、试剂1.醋酸钠缓冲液 (0.2mol/LpH4.6)2.米伦(Millon)试剂 3.95%乙醇

9、。4.乙醚。5.1O%NaCl6.0.5%Na2C03。7.0.lmol/LNaOH。8.0.2%HCl9. 饱和氢氧化钙 (Ca(OH)2)。10. 5%醋酸铅。四、实验操作 (一)酪蛋白的制备 取新鲜牛乳2Oml，放人100ml烧杯中加热至40。加入2Oml加热至同样温度的醋酸缓冲液，一边加一边摇动，并用pH计检测，调整混合液的pH为4.8（实际中准确加入牛奶与醋酸缓冲液体积相同时，可以不用调节pH）。冷却至室温，继续放置5分钟，然后将溶液转入离心管中离心3000r/min，时间5分钟 （注意离心时要对角配平），离心后清液保留做鉴定实验。所得沉淀物悬浮在约30ml等量的醇醚混合液中，搅匀，

10、离心3000r/min，时间5分钟，弃清液，所得沉淀摊在表面皿上，使醇醚混合液挥发。（二）酪蛋白的性质鉴定 1.溶解度 取试管6支，分别加入水、10%氯化钠、0.5%碳酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸及饱和氢氧化钙溶液各2m1。于每管中加入少量酪蛋白。不断摇荡，观察记录各管中的酪蛋白溶解度。 2.米伦反应 取酪蛋白少许，放置于试管中。加入lml蒸馏水，再加入米伦试剂10滴，振摇，并徐徐加热。观察其颜色变化。3.含硫 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸)测定:取少量酪蛋白溶于lmlO.1 mol/L氢氧化钠溶液中，再加入1-3滴5%醋酸铅，加热煮沸，溶液变为黑色。(三)乳清中可凝固性蛋白质的

11、鉴定 将制备酪蛋白时所得的清液移入烧杯中，徐徐加热。即出现蛋白质沉淀。此为乳清中的球蛋白和清蛋白。实验三、 血液葡萄糖的测定-福林（Folin）-吴宪氏法一、实验目的 学习并掌握福林-吴宪氏法测定血液中葡萄糖的方法二、实验原理 葡萄糖(C6H1206)是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基，而铜试剂中的二价铜(Cu2+)被还原成砖红色的氧化亚铜（Cu2O）而沉淀。氧化亚铜可使磷(砷)钼酸还原生成钼蓝，使溶液呈蓝色。其生成蓝色的深度与血滤液中葡萄糖浓度成正比。选用颜色深浅较接近于测定管一同在420nm比色，即可求出测定管中葡萄糖的含量。

12、三、试剂 1.1/24mol/L硫酸溶液 2.10%钨酸钠溶液 3.碱性硫酸铜试剂 4.磷钼酸试剂 5.0.25%苯甲酸溶液 6.葡萄糖贮存标准液 (lOmg/ml) 7.葡萄糖应用标准液(0.lmg/ml) 8. 1：4磷钼酸稀释液 四、实验步骤： 1. 用钨酸法制备1：10全血无蛋白滤液(相当于将原血稀释了10倍)。24支血糖管按表操作血糖管试剂空白管低浓度标准管高浓度标准管测定管无蛋白血滤液（ml）蒸馏水（ml）标准葡萄糖应用液（ml）碱性铜试剂（ml）2.02.01.01.02.02.02.0 1.0 1.0 2.0混匀，置沸水浴中煮8分钟，取出，用流动的自来水冷却3分钟（切勿摇动血糖

13、管）磷钼酸试剂（ml） 2.0 2.0 2.0 2.01：4磷钼酸溶液加至25252525用1：4磷钼酸溶液加至25刻度处后，用橡皮塞塞紧管口颠倒摇匀，用空白管调零，在420nm波长处进行比色，读取各管的密度值（光吸收值）。3. 计算高标准管：测定观光密度 100 0.2 =葡萄糖mg/100ml标准观光密度 0.1低标准管：测定观光密度 100 0.1 =葡萄糖mg/100ml标准观光密度 0.1实验四 双缩脲测定蛋白质的含量一、实验目的 掌握双缩脲测定蛋白质的方法和原理二、实验原理 双缩脲在碱性溶液中与Cu2+产生紫色的络合物,这一反应称“双缩脲反应”。蛋白质分子中肽键，也能与Cu2+ 发

14、生双缩脲反应，溶液紫色的深浅与蛋白质含量在一定范围内成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。该紫色的络合物在580nm处有最大吸收值，通过测定580nm处的吸光值用于谷物蛋白质含量的测定。 三、器材分光光度计 分析天平 移液管 具塞三角瓶 漏斗 三角瓶四、试剂10%KOH溶液 、无水乙醇、碳酸铜、酪蛋白、豆粉五、实验步骤：(一)标准曲线的绘制按下表加入各试剂，振荡10min，静置片刻，将上清过滤后580nm测定吸光值。以吸光值为横坐标,酪蛋白含量为纵坐标,绘制标准曲线。 编号12345678910酪蛋白（g）00.050.060.070.080.090.100.110.120.13碳酸铜（

15、g）1.1.001.001.001.001.001.001.001.001.00无水乙醇（ml）2020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0010%KOH（ml）2020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.0020.00OD580(二)样品的测定编号123豆粉（g）00.10000.1000碳酸铜（g）1.001.001.00无水乙醇（ml）2020.0020.0010%KOH（ml）2020.0020.00振荡10min，静置片刻，将上清过滤后580nm测定吸光值OD580 在标准曲线上查出相应的蛋白质的含量

16、.六、结果计算 标准曲线上查得蛋白质含量（g） 样品蛋白质含量（%）= 100 豆粉（g） 实验五 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳一、实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作技术，了解电泳技术的基本原理，测定人血清中各种蛋白质的相对含量。二、实验原理醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。本实验以醋酸纤维素薄膜为电泳支持物，分离人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 球蛋白、球蛋白、球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及行状不同（见下表），在电场中的迁移速度不同。分子量小、等电点低的，在相同碱性PH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗

17、粒在电场中迁移速度快。例如人血清蛋白在PH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次是球蛋白（如图）。三、材料、仪器与试剂（一）、材料：人血清（二）、仪器醋酸纤维薄膜(82mm)；点样器；染色皿，漂洗器，镊子；玻璃板；常压电泳仪；直流电源整流器；水平电泳槽；粗滤纸；直尺和铅笔（三）、药品巴比妥缓冲液(pH8.6)；氨基黑10B染色液；漂洗液，洗脱液 四、实验步骤：1.浸泡:用镊子取醋酸纤维薄膜放在缓冲液中浸泡20分钟。 2、点样:把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条

18、一端2-3厘米处轻轻水平地落下并随时提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3、电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜条点样的一端放在负极上。通电，电流强度每条膜22.5mA(注意强度),电泳时间约为90分钟。4、染色:电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡5分钟。5、漂洗:将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的电泳图谱。结果:实验六 植物组织中还原糖和总糖的含量测定 （3，5二硝基水杨酸法）一、实验目的 掌握还原糖总糖测定的基本原理，学习比色定糖的基本操作。二、实验原理 各种单糖和麦芽糖都是

19、还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。还原糖可用水溶液提取。总糖包括还原糖和非还原糖，其中淀粉不溶于水，可用酸水解后为还原糖，蔗糖也可水解为还原性单糖。在碱性条件下，还原糖与3，5二硝基水杨酸法共热，后者被还原为3氨基5硝基水杨酸（棕红色物质）。还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一点范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅程度成一点比例，在500nm下测定棕红色物质的消光值。查对标准曲线并计算。便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。多糖水解时，在单糖残基上接了一分子水，因此在计算时须扣除已加入的水量，测定所得的总糖量乘以0.9即可为实际的总糖。三、材料、仪器与试剂：1血糖管和刻度试管2容量瓶（50毫升）

20、3烧杯4漏斗 5移液管（10毫升）6量筒7离心管和离心机8恒温水浴9沸水浴10天平11分光光度计12试剂：3，5二硝基水杨酸、碘碘化钾溶液、酚酞指示剂、6 N盐酸、6N氢氧化钠四、实验步骤：还原糖的测定1.5g面粉+少量H2O混匀+ 50mlH2O50，20min，4000rpm,10min 取上清，20ml洗渣，合并上清，定容到100ml，混匀，过滤，待测。总糖的测定0.5g面粉+6NHCl+15mlH2O煮20min，取2d加碘碘化钾溶液检测是否完全水解（水解不显蓝）加1d酚酞，用6NaOH调至微红，定容到100ml，混匀，过滤，取10ml定容到100ml，待测。取5支试管：还原糖还原糖总

21、糖总糖空白(水)测定液（ml）221103，5二硝基水杨酸（ml）1.51.51.51.51. 5H2O00112煮5min，去除立即放入冷水这，冷却后定容到20ml，混匀，测定OD540nm,对标准曲线查还原糖的量。OD540nm标准曲线得到还原糖的量提取体积还原糖测定体积100样品毫克数标准曲线得到还原糖的量提取体积总糖测定体积稀释倍数0.9100样品毫克数实验七 应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用一、实验目的学习纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析。二、实验原理氨基酸分子上的氨基转移到-酮酸分子上的反应称为转氨基作用. 转氨基作用是氨基酸的重要反应之一,由转氨酶催化经转氨基后,原

22、来的氨基酸变成了酮酸,原来的酮酸变成相应的氨基酸。例如谷丙转氨酶可催化下列反应:COOHH2NCH CH2 CH2CH3COOHC=OCH2 CH2CH3COOHH2N CHCH3 COOHC=OCH3 + GPT +丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸新生成的谷氨酸可以与标准谷氨酸同时在滤纸上进行层析而被检出。纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物

23、质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。 Rf =纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。三、试剂1、0. 01M pH7.4 磷酸缓冲液： 2、0.1M L-丙氨酸3、0.1M L-谷氨酸 4、0.1M L-酮戊二酸5、层析溶剂 ：用水饱和的苯酚6、0.1%（W/V）茚三酮四、实验步骤1.肉糜制备：称取新鲜猪肝5克在低温下剪碎，用研钵研磨成糊状备用。2酶促反应 按表次序在2支试管中加入试剂。管号试剂对照管测定

24、管0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/L-酮戊二酸(ml)0.01mol/LpH7.4磷酸缓冲液(ml)肉糜（g）1.01.01.01.01.01.01.01.0 对照管当肉糜加入后立即煮沸lOmin，而后放人37水浴中与测定管同时保温，测定管加入肌肉糜后放人37水浴中保温lh，然后于沸水浴中加热10min终止反应。冷却后将二管分别静置以备层析用。 3.层析 取直径10-llcm圆形层析滤纸（已打孔）一张，通过圆心作一直径为2cm的圆，在圆周上分别取4等距点分别作测定管和对照管溶液及标准丙氨酸、谷氨酸的点样位置，点样时，将蘸水笔（使用前应放在酒精灯上烧红，冷却，对应溶液只能用对应的笔点

25、样）轻轻靠到滤纸上(不能损伤滤纸)，使斑点直径为2-3 mm (不能超过5mm)。为了有足够量的样品点在滤纸上，每种样品应重复点6-7次，每次点样后待自然风干，再点下一次。另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成灯芯插人中心小孔处，使灯芯不突出纸面(少许突出纸面亦可)。然后将该层析圆滤纸平放在盛有水饱和酚的康维皿上，纸芯下端须状部分浸人溶液中，再在层析滤纸上罩一个大小合适的表面皿，溶剂沿纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，待溶剂前沿到达距康维皿边缘0.5-lcm处时 (约lh左右)，取出层析滤纸，去掉纸芯，记下溶剂前沿，在电炉子上烘干以除去酚溶剂。 将已烘干的滤纸平放于表面皿上，用喷雾器向滤纸均匀喷洒0

26、.1%茚三酮溶液，放在电炉子上烘干即可看到好几个紫红色斑点，比较各色斑点的位置及色 泽深浅，并计算Rf值，分析实验结果。结果与讨论:测定管:出现了几个点: Rf1？; Rf2？说明是否发生了转氨基作用对照管中只出现了几个点,为什么？标样：丙氨酸: Rf2？谷氨酸Rf2？实验结果说明,要发生转氨基作用,必须具备几个条件实验八 植物组织中维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）一、实验目的维生素C是人体必需的营养元素，它广泛存在于各种蔬菜和水果中，但在不同的材料中Vc的含量是不同的，因此Vc含量的测定对于营养膳食是非常重要的。二、实验原理 还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚钠盐，本身

27、则氧化成脱氢抗坏血酸，在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，被还原后变为无色。因此，可用2,6-二氯酚靛酚滴定样品中还原抗坏血酸。当抗坏血酸全部被氧化后，稍候多加一些染料，使滴定液呈淡红色，即为终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的标准染料与样品中所含的还原型抗坏血酸成正比。三、材料、仪器与试剂：1微量滴定管 （5.0毫升）2容量瓶（50毫升）3三角瓶（100毫升）4研钵5移液管（10毫升）6量筒72%草酸溶液 8标准抗坏血酸溶液90.1%2,6-二氯酚靛酚溶液10新鲜蔬菜或松针 四、实验步骤：1.提取:称取2.0克新鲜样品，置研钵中加少量 2%草酸研成匀浆。通过漏斗将匀浆转移到50毫升

28、 的容量瓶中，用2%草酸洗涤研钵及漏斗（注意体积），洗涤液一并转入容量瓶中，最后用2%草酸定容至刻度。（也可选择离心）2.滴定：（1）标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸溶液10毫升（含1.0毫克抗坏血酸）置100毫升锥形瓶中，用滴定管以0.1%2，6二氯酚靛酚滴至淡红色出现，保持15秒钟不退色即为滴定终点;由所用染料的体积计算出1毫升染料相当于多少毫克抗坏血酸。(2)样液滴定:准确吸取滤液两份，每份10毫升分别放人100毫升锥形瓶内，滴定方法同前。（3） 空白滴定：准确吸取10毫升2%草酸溶液，放入100毫升锥形瓶中，用上述方法滴定至终点，记录所用染料体积。注意：滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟

29、。3计算1000克样品所含维生素C的毫克数。 （V1V2）KV X = 100 WV3式中：X ：100克样品所含维生素C毫克数W ：称取样品重量毫克数V1：滴定样品所用染料毫升数V2：滴定空白所用染料毫升数V3：样品测定时所用滤液毫升数（即10毫升）V ：样品提取液稀释至总体积（即50毫升）K ：1毫升染料所能氧化维生素C之毫克数，可由标定算出。实验结果记录各个样的滴定体积并正确计算，单位一定要对实验九 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、实验目的了解琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制剂对其活性的抑制。二、实验原理脱氢酶的作用在于激活并脱下底物上的氢，使之通过一系列传递最后传给氧而生成水

30、。在缺氧条件下适当的受氢体可以接受脱氢酶脱下的氢。因此，选用适当的受氢体便可以观察到脱氢酶的作用。琥珀酸脱氢酶使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，并将脱下的氢交给受氢体。当缺氧条件下可用甲烯蓝（美蓝，蓝色物质）作为受氢体，甲烯蓝还原生成甲烯白（美白，白色物质）。根据这种蓝色转变为无色的变化过程，就可以判断出琥珀酸脱氢美起了催化作用。丙二酸的结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争酶的活性中心，从而抑制酶的活性，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。由于甲烯白容易被空气所氧化，所以实验需要在无氧条件下进行。例如，用液体石蜡封闭反应液，可以制造无氧环境，从而不用抽真空设备即可观察实验结果。三、实验试剂和器材 1.5%琥珀酸

31、钠溶液、1.0 %丙二酸钠溶液、0.02%甲烯蓝溶液、液体石蜡、手术剪、研钵、恒温水浴锅、石英砂四、实验步骤猪心1.52g + 1/15M磷酸氢二钠溶液34ml 匀浆1/15M磷酸氢二钠溶液67ml,放置30min2000r/min 离心10min,取上清备用.然后按下表进行操作:试管号酶液(滴)琥珀酸钠溶液丙二酸钠溶液蒸馏水甲烯蓝溶液现象155-25225(煮沸)5-25231055152410205-2 加好试剂混匀后,立即在各管中加入一层(约510滴)液体石蜡油。将各管置于37水浴中保温，30min内观察各管颜色变化。比较颜色变化的速度，并分析原因。然后将第1支试管用力振摇，观察有何变化

32、，记录并解释现象。实验十 植物组织中DNA的提取与鉴定一、实验目的掌握DNA的提取方法。二、实验原理 DNA是生物细胞中的一种重要组成成分之一，主要存在于细胞核中。天然的DNA绝大多数与组蛋白结合在一起。从细胞中提取DNA时，一般先得到的是DNP，比国内切杂有RNP，必须将蛋白和RNA除去，才能得到DNA。DNP和RNP在盐溶液中溶解度不同，RNP在稀盐中溶解度最大而DNP溶解度最低。DNP在1M的NaCl中的溶解度最大，而RNP则最小。因此，可利用此性质将两种核蛋白分开。分开得到的DNP可用SDS使蛋白变性后与DNA分开，用C:I（变性蛋白并除去脂类物质的功能）除去蛋白，最后用95%的乙醇从

33、溶液中将DNA沉淀出来。操作中为了防止DNA酶对DNA的降解，提取液中加入柠檬酸盐、EDTA抑制其活性，且低温操作，还需要加热的方法灭活DNA酶。为了防止酸性物质（可溶性糖、无机磷）、色素的干扰，可加入高氯酸盐、乙醇。鉴定DNA用二苯胺法。在强酸加热条件下，DNA中的嘌呤与脱氧核糖间的糖苷键断裂，脱氧核糖脱水生成羟基酮基戊醛，该物质和二苯胺生成蓝色的化合物，乙醛可在家蓝色的发色量。三、材料、仪器与试剂：1研钵 2有刻度烧杯容量瓶（50毫升）3滴管4剪刀5离心管6量筒7洗耳球 8试剂：研磨用缓冲液、SSC溶液、C:I、SDS、1盐酸、95乙醇、10氢氧化钠、二苯胺乙醛 10材料：麦芽 四、实验步

34、骤：麦芽5g+5ml研磨缓冲液0.1gSDS研磨成匀浆转入烧杯，用研磨缓冲液洗几次加入等体积的C:I振荡30秒，4000rpm,5min取上清，72水浴34min，灭活DNA酶加入1/4 体积5M高氯酸钠加入C:I，振荡30秒，4000rpm,5min取上清，加入2倍体积冰冷的95%的乙醇，（用滴管慢慢沿烧杯壁加入，用玻璃棒顺一个方向快速搅动，此时可将DNA的纤丝绕在棒上；若没有纤丝出现，可4000rpm，5min，去上清，的DNA沉淀。）将DNA纤丝在烧杯壁上轻轻挤压，除去乙醇，将乙醇用滤纸吸干，将DNA置于烧杯中，加2mlSSC溶液将其溶解，加二苯胺乙醛溶液2ml，6080加热15min，观察颜色。另取一只试管只加22mlSSC溶液，二苯胺乙醛溶液2ml，6080加热15min，观察颜色。-