结直肠癌细胞论文-精品文档.docx

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1、结直肠癌细胞论文1材料与方法11小鼠DC细胞分离培养67断颈处死小鼠，75酒精中浸泡5min，超净台中无菌取出小鼠的股骨、胫骨，剪去两端，用1mL注射器吸buffer刺入骨髓腔，反复冲洗直至骨发白，200目滤网冲过滤，收集细胞悬液，离心300g，10min，参加红细胞裂解液，离心去上清，buffer清洗沉淀后再次离心。用含10胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，接种于24孔板1106mL，参加细胞因子GM-CSF50ngmL、IL-425ngmL，37，5CO2，进行培养。48h后，弃培养基，PBS清洗1遍，参加新的培养基。之后隔天半量换液。第8天参加LPS继续培养24h，离心收集的悬

2、浮细胞即为DC细胞。12CT26WT细胞与全T细胞共培养37，5CO2培养的CT26WT细胞待密度超过80，胰酶消化，计数待用。T细胞CT26WT101进行混合培养，48h后做实验研究。13DC细胞与T细胞共培养腹腔注射第1、15天的DC细胞与对应的T细胞，调至适当浓度至1106个mLDCT110，参加96孔板，100L孔，混合培养48h。每组设5个复孔，同时设单独DC细胞孔、单独T细胞孔。刺激能力的计算：混合孔单独DC细胞孔单独T细胞孔。14B7H4的检测取新鲜的人结直肠癌组织及配对的正常肠上皮组织8对；CT26WT细胞腹腔注射第15天的BALBc小鼠，待腹腔成瘤后，取肿瘤组织及配对的正常肠

3、组织1对，IHC检测B7H4的表达；腹腔注射的第0、1、2周，取小鼠肠组织及肿瘤组织，WesternBlot检测组织蛋白B7H4的表达。15统计学方法所有数据采用SPSS170统计软件进行单因素方差分析、t检验等。P005为差异有统计学意义。2结果21DC细胞在镜下的细胞形态第8天可见多数细胞呈集落样生长。22腹腔注射不同时间段的全T细胞对CT26WT的杀伤效应腹腔注射不同时间段1、3、5、7、9、11、15d全T细胞与CT26WT10：1混合共培养48h后，CCK8结果示第7天，活细胞数开场略上升，第15天最高第1天：OD124400025146；第15天：OD305767086557；P0

4、000，差异有统计学意义，图2；第1、15天的共培养体系进行细胞凋亡检测：第15天细胞凋亡率降低第1天：CT26凋亡率866704055；第15天：CT26凋亡率363304910；P0001，差异有统计学意义。23流式细胞术检测DC细胞表型腹腔注射的第1、15天，DC细胞外表分子MHC-阳性率7900019348vs5100029180比拟，差异有统计学意义。24DC细胞外表分子ICAM-1的表达搜集腹腔注射不同时间段0d正常小鼠，1、3、5、7、9、11、15d的DC细胞，WesternBlot检测ICAM-1的表达。第9天其表达开场下降，第15天最低。25IHC检测B7H4在正常肠上皮N

5、和癌组织T中的表达WesternBlot检测腹腔注射不同时间段小鼠组织B7H4的表达9对组织8对人来源的，1对鼠来源的均显示B7H4在癌组织中表达增高图5。腹腔注射第0、1、2周，正常肠上皮组织第0周B7H4表达很微弱，第1、2周，腹腔内已有肿瘤构成，肿瘤组织B7H4表达上升。26腹腔注射1、15天，DC细胞刺激T细胞增殖能力的比拟第1天：2770017214；第15天：2330016836；P0000，差异有统计学意义。3讨论肿瘤免疫机制是一个复杂的网络系统，已有研究发现：B7H4能够抑制T细胞的激活和增殖；TGF-能够诱导免疫抑制12；结直肠癌来源的成纤维细胞能够抑制自然杀伤细胞的功能等1

6、3。1970年，Bretscher和Cohn已证明“协同刺激信号决定着T细胞免疫的方向，在宿主抵抗外来入侵时至关重要，而T细胞活化的第一信号就来源于APC所提呈的抗原。DC细胞是1973年由Steinman等14首先发现的，是目前所知抗原提呈能力最强的APC，而T细胞活化则需要两个信号：第1信号来自DC等细胞提呈的抗原，第2信号则为共刺激分子包括B7CD28、ICAM-1LFA-1、LFA-3CD2等，缺乏任一信号T细胞都不能有效地发挥处理肿瘤细胞的能力。本研究将CT26WT腹腔注射入BALBc小鼠体内，动态观察其对宿主产生的影响，利用该细胞株的高侵袭性，短时间内构建肿瘤与免疫的模型。利用T细

7、胞与肿瘤细胞共培养，发现T细胞的杀伤能力下降，其后对这一结果做进一步研究，着重观察抗原递呈的改变。发现随着腹腔注射时间的延长，抗原提呈细胞DC细胞外表分子MHC-的表达降低；LFA-1ICAM-1介入T细胞的活化、增殖、分化及归巢等多种生理经过，WesternBlot检测发现DC细胞外表分子ICAM-1表达也下降。最终使T细胞杀伤CT26WT细胞的能力下降。另外，肿瘤细胞外表分子发生改变也是肿瘤逃逸的原因，本研究取新鲜的结直肠癌组织标本，以及腹腔注射第1、2周的小鼠结肠癌组织，免疫组化及WesternBlot检测均发现肿瘤高表达B7H4，这又进一步抑制了T细胞的活化。综合以上对BALBc小鼠体内外实验的初步探究，提醒我们在关注肿瘤本身的同时，也应将目光聚焦于与肿瘤生存密不可少的免疫环境。研究表明用肿瘤细胞mRNA致敏DC细胞能够产生特异性抗肿瘤反响，了解高表达B7H4的肿瘤细胞与DC细胞之间的微观分子机制，明确DC细胞与肿瘤的相关信号转导途径的关系，将对肿瘤的治疗与预防有着重要的意义。