高通量药物筛选技ppt课件.ppt

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1、高通量药物筛选技术高通量药物筛选技术运用自动化的筛选系统在短时间内、在特定的筛选模型上完成数以千计，甚至万计化合物样品的活性测试。一般而言，日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选。分子生物学分子生物学细胞生物学细胞生物学基因组学基因组学蛋白组学蛋白组学生物信息学生物信息学结构生物学结构生物学计算机辅助药物设计计算机辅助药物设计药物化学药物化学高通量筛选高通量筛选技术技术天然产物天然产物化学合成化学合成组合化学组合化学化合物库化合物库筛选模型筛选模型结构优化结构优化先导化合物先导化合物筛选筛选药物发现的关键环节药物发现的关键环节高新技术集中的焦点高新技术集中的焦点The Evolut

2、ion of HTS高通量筛选的特点高通量筛选的特点快速快速-每天筛选上万药次每天筛选上万药次微量微量-筛选样品需要量为微克级筛选样品需要量为微克级灵敏灵敏-准确判断筛选样品的活性和选择性准确判断筛选样品的活性和选择性经济经济-筛选费用低筛选费用低高通量筛选的四个要素高通量筛选的四个要素样品制备样品制备自动化自动化HTS模型建立模型建立数据处理数据处理要素一：高通量筛选模型建立要素一：高通量筛选模型建立针对某一特定靶点，设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选。选择高通量筛选的靶点选择高通量筛选的靶点来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现。根据这些结果，我们可以选择其中关键

3、的生物效应环节进行干预。这些靶点包括受体、酶、激素、因子、离子通道和蛋白间的相互作用等。Current Drug Targets Membrane Receptors45% Enzymes28% Hormones and Factors11% Ion Channels5% DNA2% Nuclear Receptors2% Unknown7%N = 483 J. Drews, Science (2000) 287:1962克隆克隆PCR、RT-PCR方方法从法从cDNA文库、文库、EST克隆、组织克隆、组织和细胞的总和细胞的总RNA中得到关键靶基中得到关键靶基因因亚克隆亚克隆大肠杆菌表达系统酵

4、母表达系统昆虫表达系统大规模表达、大规模表达、纯化、复性，纯化、复性，得到纯净重组得到纯净重组蛋白蛋白时间光吸收NONHONHOSONHONHOOOEtSHONHONHOOEtSSCOOHHOOCNO2O2NSCOOHNO2E412nm =13,600 M-1cm-1检测方法的确检测方法的确定、优化及高定、优化及高通量筛选模型通量筛选模型的建立的建立分子水平筛选模型建立流程模型设计模型设计体外生化检测通常通过体外生化检测方法进行筛选的靶点包括酶、受体、蛋白与蛋白的相互作用等细胞水平的检测主要用于信号传导通路相关的靶点（包括受体、离子通道）以及为发现抗生素设计的筛选模型通过显色反应、荧光、化学发

5、光以及同位素检测技术测量生物反应的终点。体外生化检测体外生化检测体外生化检测均相检测异相检测放射性检测非放射性检测放射性检测非放射性检测SPA 微粒SPA 微孔板显色反应检测吸收光检测荧光检测 微粒方法检测过滤方法检测吸收方法检测沉淀方法检测放射免疫ELISA 检测显色反应显色反应(Photometry)No2NHRONo2H2N 405nm=1.06104 M-1cm-1RSNHROOHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHROSO2NHO2CSNO2CO2H+412nm=1.4104 M-1cm-1HSNHROEE显色反应方法检测显色反应方法检测MetAPMetAP活性活性maxnmH2N

6、NSOMetAPMet+ONHNO2HNONHNO2ProAPH2NNO2NHOHO显色反应方法检测显色反应方法检测MetAPMetAP活性活性H2NSNHOHSOOROHSNHOHOROHSNO2CO2HO2NHO2CSSNHOROHOMetAPMetSO2NHO2CSNO2CO2H+R=Ph,CH3=412nm以酶为靶点以酶为靶点以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤：步骤：确定反应条件（如缓冲液、确定反应条件（如缓冲液、pH、温度）、温度）天然或合成的底物的确定天然或合成的底物的确定酶动力学酶动力学信号窗口的评价信号窗

7、口的评价对已知抑制剂的反应情况对已知抑制剂的反应情况底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学底物转变为产物后，分别使用显色反应、荧光或放射性化学的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，的方法等。适用的靶点不仅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶类，如也包括其它酶类，如DNA连接酶和解旋酶。连接酶和解旋酶。细胞水平检测细胞水平检测细胞水平检测均相检测异相检测微生物检测哺乳动物细胞检测存活检测生长/生长抑制检测报告基因检测混合检测细胞毒性和细胞增殖检测双杂交检测报告基因检测放射性检测非放射性检测放射性检测过滤方法检测放射免疫ELISA 检测非放射性功能检测荧光成像检测荧

8、光成像检测(FLIPR)贴壁细胞或悬浮细胞中贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度，间接反的荧光强度，间接反映钙离子的浓度。在映钙离子的浓度。在FLIPR实验中，可以用实验中，可以用96孔或孔或384孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程孔板对多个样品同时检测，测定荧光强度的过程仅需仅需1秒。可进行钙离子内流的动力学检测。秒。可进行钙离子内流的动力学检测。FLIPR functional screening assayLGTPGDP PLCinositol phosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescent signal要素二：化合物样品库制备要素二：化合

9、物样品库制备 结构多样性（结构多样性（Chemical diversity） 类药性（类药性（Drug-like)Lipinski规则规则 MW 500 分子量 ClogP 5 计算疏水常数 H bond donors 5 H键供体 H bond acceptors 10 H键受体Properties of an “Average” DrugUndesirable Compounds Unstable Reactive Michael acceptor Toxic Liquid General metal chelator Polyaromatic metallocompound筛选样品来源筛

10、选样品来源 传统化学合成、分离传统化学合成、分离 合成化合物合成化合物 分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位分离的天然产物纯化合物和粗提物、有效部位 组合化学合成组合化学合成 从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物从化合物数量和结构多样性上，充实供筛选的化合物库库 与其他机构的合作、交换或购买与其他机构的合作、交换或购买传统化学合成和分离传统化学合成和分离 单个合成、分步纯化 一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个特点：数量相对较少，但各化合物相关数据全，质量较高对特定的靶点SAR明确，对一个全新靶点，这些知识有助于产生新的先导化合物发掘天然产物资源发掘天然产物资源大自然是

11、另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物大自然是另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物的主要来源。的主要来源。 经典方法经典方法-分离纯化、结构鉴定、活性测试分离纯化、结构鉴定、活性测试-费时、费时、效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在效率低，远远不能满足现代高通量筛选的需要。这在一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研究中受重视程度。物研究中受重视程度。 从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结从结构多样性的角度考虑，大自然可能给予我们的结构多样性大大高于组合化学，因而天然产物或天然来构多样性大大高于组合化学，

12、因而天然产物或天然来源的样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化源的样品的重要性不容忽视。这也是现代天然产物化学研究的新的切入点。学研究的新的切入点。天然化合物库（天然化合物库（Nature Product Pool）尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，但至今尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过，但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似乎给我们这样一种信息：随着新的药物筛选模型的不断涌现，乎给我们这样一种信息：随着新的药物筛选模型的不断涌现，一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。一些已知的天

13、然化合物可能会被发现具有全新的生物活性。天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物对新药发现和开发的重要性天然产物，特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老，为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣？为什么自然界能产生对人体疾病有效的为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质？物质？化学家和生物化学家对次级代谢产物（所有非蛋白天然产物）的产生提出了六种主要的假设，Haslam归纳如下：1）次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物；2）次级代谢产物曾经起过功能代谢作用，但目前其作用已失去

14、；3）次级代谢产物是所有体内变化的产物，在生物体内没有任何真正的作用；4）次级代谢产物是进化过程中的一例，在新化合物产生之前，次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在；5）次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所，重要的是次级代谢过程，而不是次级代谢产物；6）次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质，对生物体的生存具有重要作用。为什么为什么2020世纪后半叶对从天然产物寻找世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣？新药失去了兴趣？ 20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能 ； 随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展，每天可以筛选50000

15、个以上的样品，为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法； 天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易。天然产物研究的复活天然产物研究的复活 天然产物研究的成功 天然产物研究的独特性 新筛选方法的影响根据新药的研发过程设计有效的天然产物研根据新药的研发过程设计有效的天然产物研究方法究方法 天然材料的获得和提取 有效的筛选方法 天然生理活性物质的分离 快速有效的结构解析方法 生物学的评价 天然生理活性物质的大量获得 构效关系研究天然产物或其类似物作为药品实例天然产物或其类似物作为药品实例61% of 877 small molecule drugs introduced worldwide

16、 during the period 1981-2002 can be traced to, or were inspired by, natural products. 洛伐他汀洛伐他汀 (Lovastatin)(HMG-CoA抑制剂）抑制剂）R1MeHOMeOOOHOHMeR2HCompactin:R1=R2=HMevinolin: R1=CH3,R2=HSimvastin: R1=CH3,R2=CH3NMeMeCO2HFHOHNOOHOHCO2HFHOHNMeMeMeMeMeONMeMeOHCO2HFHOHMeHOMeOONaO2CHOHMeHOHHOPravastatinFluvast

17、atinCerivastinAtorvastin环孢菌素环孢菌素A（Cyclosporine A）NNHHNNOOOOHNOONHNNNOOOOONHOH真菌Trichoderma polysporum分离抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂紫杉醇HAcOBzOOOHOR1OHOOOOHNHR21. Paclitaxel R1=Ac, R2=Bz2. Docetaxel R1=H, R2=Boc231013紫杉醇(1 1, Paclitaxel, Taxol)是从太平洋红豆杉Taxus brevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物。多西紫杉醇(2 2, Docetaxel, Taxote

18、re)是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上，多西紫杉醇年销售额达到10亿美元以上。这两种药物已经成为当前，也是历史上最为畅销的抗癌药物。 NNOR1R2R3OOHOH3CNNOO喜树碱及其衍生物喜树碱及其衍生物Camptothecin R1=R2=R3=HTopotecan R1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrinotecan R1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-Aminocamptothecin R1=R3=H,R2=NH29-Nitrocamptothecin R1=R3=H,R2=NO2(A)喜树碱

19、及其衍生物是DNA局所异构酶 (DNA toposomerase 抑制剂。ROOHOHNCH3HOOHHOH3CONCH3NHOCH3CH3HHCH3H3C吗啡生物碱吗啡生物碱Morphine,R=HCodeine,R=CH3Buprenorphone,活性为Morphine2550倍，成瘾性低于吗啡。Pentazocine,活性仅为吗啡的30，但成瘾性极低天然产物研究的未来利用组合化学合成“非天然的天然物”或“类天然产物库”多样性导向合成多样性导向合成 (diversity-oriented synthesis)Galanthamine 四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂四环骨架化合物库

20、的建立和分泌途径抑制剂及高尔基及高尔基-质膜运输抑制剂质膜运输抑制剂Secramine A 的发现的发现Shair M D and Kirchhausen T. Nature chemical biology, 2006, 2: 39-462527 compounds were synthesizedCompound Storage Solid Long-term storage DMSO solution Long-term storage (10 year?) Working solutionsCompound plates Mother Plates DMSO solutions fro

21、m vendors Daughter Plates DMSO solutions 1 mg/ml Assay Plates Aqueous solutions 25 g/mL compound 2.5% DMSO 20 L123456789101112ABCDEFGH123456789101112131415161718192021222324ABCDEFGHIJKLMNOP80 Compounds352 Compounds88 CompoundsSample management technology化合物库是医药公司和研究机构最宝贵的资产。其数量和质量的重要性需要高可靠性的自动化储存和检索

22、系统。专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品，包括：自动化的储存系统大型系统可储存60,000,000样品。储存环境温度可达到-80 。自动化样品处理设备样品称量、溶解，微孔板间复制，封膜，Cherry picking。软件储存系统控制软件，样品管理系统软件。耗材微孔板，微试管，封膜，Barcode.Sample management technology 瑞士Tecan公司的样品自动化储存系统产品Click to view the videoREMP Large-size storeTM (LSS)要素三：自动化要素三：自动化 自动化技术的应用，提高筛选效率，摆脱人为误差因素微孔板（微孔

23、板（Microplate） 微孔板（Microplate）是许多方法和解决方案的最终决定因素。尽管近年来的芯片技术发展很快，但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不可替代的角色。正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行方式同时处理的概念，这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系统和工作站的快速发展。对于所有开发的仪器而言，微孔板是一个共同的标准，同时标准化的要求也增加了现代自动化系统的可靠性。其中，96孔板和384孔板都已经制定了相应的标准(Society of Biomolecular Screening task force Standards in Automation and inst

24、rumentation)。但是其他的高密度板，如864、1536、3456，甚至9600孔板目前还没有统一的标准。这些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本，同时增加了通量。 Microplates 微孔板是筛选的载体，其制造技术也随着筛选技术的发展而发展，包括： 微孔板的颜色和材料 微孔板微孔的设计和密度 微孔板材料的表面处理Microplates from CorningMatrix of Wells864963841536 WellRowColumnVolume9681230038416241001536324810Microplates 微孔板的颜色和材料颜色类型应用透明 光吸收

25、检测不透明黑色：荧光检测白色：化学发光检测底部透明细胞实验，底部检测材料类型应用聚苯乙烯（PS）疏水性，透明度高，多用于筛选板聚丙烯 （PP）化学稳定性高，适合化合物储存UV透射材料光吸收率低，适合UV检测Microplates 微孔板微孔的设计和密度 微孔板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量。 节约成本。 提高筛选质量。微孔密度96孔384孔1536孔3456孔微孔容积75-250 mL20-100 mL2-10 mL1mLMicroplates 微孔板材料的表面处理类型应用与生物分子无亲和力Corning公司NBSTM微孔板：均相生化测试与生物分子高亲和力非均相测试，例如：EL

26、ISA, DELFIA为细胞组织培养特别处理Corning公司的CelllBind微孔板：提高细胞贴壁性多聚赖氨酸表面：超低细胞亲和力表面：降低细胞贴壁能力共价处理表面与DNA，碳链，巯基有特异的亲和力微孔板设备微孔板设备一般而言，一个自动化筛选系统的大多数组件总是围绕微孔板而工作的，它们均可称为微孔板设备。 独立单元（Stand-alone）：指象洗板器、液体分配器（Liquid Dispenser）和酶标仪等 工作站（Workstation）：能执行多重功能（通常指围绕微孔板）的部分， 如液体转移装置（Liquid Handling）可围绕微孔板执行多重功能History 1980s, Z

27、ymark世界上第一台工作站是由Zymark公司开发的BenchmateTM系统，它集成了精密天平、单通道加液头、移液装置、振荡器和HPLC进样器等。通过一个机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个工作台，但这一系统主要是针对管形反应器设计而设计的，并不适用于今天的微孔板。第一台基于于微孔板设计的工作站是由Beckman Coulter开发的Biomek1000，它整合了单通道和多通道的吸液、加液、洗涤和单通道检测（密度测定）等组件部分。Biomek2000： 使用可变换工具后变得更加灵活，如不同的吸收器、分配器等。其特点是可以针对不同的需要设计不同的操作程序。BiomekFX：集成了更强

28、大的功能，如多通道可同时、亦可执行不同的任务，双手臂操作则更是增加了有效性和操作速度。Biomek 2000 Automation Workstation 自动化液体分配装置自动化液体分配装置检测系统检测系统 UV-visible Light Absorbance Fluorescence Fluorescence Intensity Time-resolved Fluorescence (TRF) Fluorescence Polarization (FP) Luminescence RadioactivityMicroplate ReadersSpectraMax Plus 384 UV

29、absorbanceContinuous 190 - 1000 nm, Reads 96 wells, 5 sec; 384 wells,16 secSpectraMax Gemini XS Luminescence, fluorescence and time-resolved fluorescenceContinuous 250-850 nmRead 96 wells, 27 sec; 384 wells, 2 min 30 secVICTOR2 V Multi-label Reader Filter-based instrument Five technologies: Absorban

30、ce Luminescence Fluorescence Time-resolved fluorescence Fluorescence polarizationMicroplate reader 最新的微孔板检测器具备高速，高灵敏度，通用的特点。 PerkinElmer公司的EnVision 检测器可以在36s内完成对一块1536孔板的荧光强度检测。 整合了光吸收，荧光强度，荧光偏振，时间分辨荧光，化学发光，激光等多种检测手段。EnVision (PERKINELMER)Safire (TECAN)SpectraMax M5 (Molecular Devices)自动化系统自动化系统(Automated Robotic System)自动化系统是指集独立单元、工作站于一个特定的功能环境，由一种总系统软件控制，由一至二个机械臂完成微孔板在独立单元和工作站之间的转移工作。可重复编程的机械装置系统，能自动重复完成包括自动称量、液体转移、分离、仪器硬件的转移等。自动化系统的组成自动化系统的组成 机器人 控制器 机械手 伺服轨道 外围设备微孔板设备：液体转移装置，培养箱，洗板器、液体分配器和酶标仪等高通量药物筛选技术高通量药物筛选技术