葛根和葛花的解酒护肝作用及其机理研究_高学清.docx

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1、 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被査阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复

2、制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 摘 要 课题主要研宄葛根和葛花对急性和慢性酒精肝损伤小鼠的影响，分析比较葛根和 葛花的解酒护肝作用，并在此基础上探讨其作用机理。 急性酒精中毒实验主要通过测定小鼠的醒酒时间和血醇浓度变化分析比较葛根和 葛花的解酒效果。先采用水提和醇提法分别提取葛根和葛花并通过冷冻干燥得到 4 种 葛根和葛花粗提物 (PRW/PRE/PFW/PFE)。模型组按 10mL/kg.bw 体积灌胃生理盐水， 低中高各葛根和葛花实验组分别按 2.5、 7.5、 10 g/kg.bw 生药剂量灌胃相应的粗提物

3、溶 液； 30 min 后各实验组按 5.75 g/kg.bw 灌胃酒精。结果表明葛根和葛花对均具有一定的 解酒预防效果；且葛根的解酒预防效果优于葛花，葛根醇提物优于葛根水提物，高剂 量组优于低剂量组。 慢性酒精肝损伤实验在评价葛根提取物 (PR) 和葛花提取物 (PF) 对小鼠生理病理指标 影 响 的 基 础 上 ， 从 氧 化 应 激 、 脂 质 代 谢 、 炎 症 信 号 传 导 等 3 个 方 面 探 讨 PR 和 PF 的 作 用机理。 将小鼠分为 7 组： 空白组、 模型组、 PR 低高剂量组 (100 和 300 mg/kg.bw 总黄 酮 PR)、 PF 低高剂量组 (100

4、和 300 mg/kg.bw 总黄酮 PF)和阳性组 (FB, 500 mg/kg.bw)。 空 白 组 灌 胃 蒸 馏 水 ， 其 它 各 组 灌 胃 50% 乙 醇 ； lh 后 ， 空 白 组 和 模 型 组 灌 胃 6 mL/kg.bw 蒸 馏 水 ， 其 它 各 组 灌 胃 相 应 剂 量 的 提 取 物 溶 液 ， 11 周 后 处 死 小 鼠 。 结 果 表 明 PR 和 PF 可 有 效 抑 制 谷 草 转 氨 酶 和 谷 丙 转 氨 酶 活 性 ， 减 轻 肝 细 胞 肿 胀 ， 减 少 脂 滴 ， 表 现 出 较 好 的 护 肝 效 果 。 在 氧 化 应 激 方 面 ，

5、PR 和 PF 可 提 高 肝 组 织 的 抗 氧 化 能 力 ， 并 降 低 内 毒 素 (LPS) 浓 度 及 抑 制 细 胞 色 素 P4502E1(CYP2E1) 表 达 ， 减 少 自 由 基 产 生 ， 从 而 减 轻 氧 化 应 激 导 致 的 肝 损 伤 。 且 PF 提 高 抗 氧 化 的 能 力 和 对 CYP2E1 表 达 的 抑 制 作 用 强 于 PR 。 在 脂 质 代 谢 方 面 ， PR 和 PF 均 可 上 调 腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶 a2 (AMPKa2) 表 达 量 ， 但 两 者 的 差 别 在 于 ： 在 活 化 AMPKa2 的 作 用

6、下 ， PR 可 显 著 抑 制 固 醇 调 节 因 子 结 合 蛋 白 lc (SREBP-lc) 转 录 活 性 ， 进 而 抑 制 甘 油 三 酯 (TG) 合 成 。 而 PF 可 能 作 为 一 种 配 体 激 活 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 a (PPARa) 或 受 AMPKa2 激 活 作 用 进 而 提 高 PPARa mRNA 表 达 量 ， 促 进 脂 肪 酸 氧 化 分 解 ， 达 到 降 低 脂 的 作 用 。 且 PR 降 脂 作 用 优 于 PF。 在 炎 症 信 号传导方面， PR 和 PF 可降低 Toll 样受体 4(TLR4) 及髓

7、样分化蛋白 88 (Myd88) 表达量， 抑 制 炎 症 信 号 放 大 ， 同 时 还 可 提 高 核 因 子 KB 抑 制 剂 a (iKBa) 水 平 ， 进 而 与 活 化 的 核 因 子 KB (NF-KB) 结 合 形成 NF-KB/IKBOI 复 合 物， 从 而 有效 抑 制 酒 精性 肝 炎 。 且 PF 的 抑 炎 作用强于 PR。 以 上 结 果 表 明 葛 根 和 葛 花 均 具 有 一 定 的 解 酒 护 肝 作 用 。 葛 根 主 要 通 过 上 调 达 量 进 而 抑 制 SREBP-lc 的 转 录 活 性 ， 抑 制 TG 合 成 。 葛 花 一 方 面 通

8、 过 提 高 肝 组 织 抗 氧 化 能 力 ， 抑 制 CYP2E1 表 达 ， 并 降 低 炎 症 信 号 分 子 TLR4 及 Myd88 表 达 水 平 ， 减 轻 氧 化 应 激 和 炎 症 性 肝 损 伤 ； 另 一 方 面 葛 花 可 能 作 为 一 种 配 体 激 活 PPARa 或 受 AMPKa2 激 活 作 用 从 而 提 高 PPARa 表 达 量 ， 促 进 脂 肪 酸 氧 化 分 解 ， 降 低 脂 质 水 平 。 关键词：葛根；葛花；总黄酮；急性酒精中毒；慢性酒精肝损伤 ii Abstract The main objectives of this subject

9、 is to discuss the effect of Radix Puerariae and Puerariae Flos on the acute and chronic alcoholic liver injury in mice, and draw a comparison about the sober-up and hepatoprotective effect between Radix Puerariae and Pueraria Flos. To compare the sober-up effect of Radix Puerariae with Puerariae Fl

10、os, the sober time and ethanol concentration were determined. Firstly, Radix Puerariae and Puerariae Flos were extracted respectively by water and ethanol, and freeze-dried to be four kinds of crude extracts of Radix Puerariae and Puerariae Flos (PRW/ PRE/PFW/PFE). The model group was administered i

11、ntragastrically saline 10 mL/kg.bw， while the the low， medium and high dose groups were respectively given 2.5, 7.5 and 10 g/kg bw of Radix Puerariae or Puerariae Flos crude extracts; 30 mins later, each group was afforded ethanol 5.75 g/kg.bw. The results show that Radix Puerariae and Puerariae Flo

12、s have a certain sober effect on the drunken mice. The sober-up effect of Radix Puerariae is better than that of Puerariae Flos, and the PRE is better than PRW as well as the effect of higher dose is better than that of lower dose . In the chronic alcoholic liver injury experiment, the hepatoprotect

13、ive effect of Radix Puerariae extract(PR) and Puerariae Flos extract(PF) on liver are firstly evaluated by the physiological and pathological indicators. On the results of previous indicators, the mechanisms of PR and PF on alcoholic liver were discussed from the following three aspects: oxidative s

14、tress, lipid metabolism and the inflammatory signal transduction. Mice were divided into seven groups: blank group, model group, PRL and PRH groups (100 and 300 mg/kg.bw total flavones of PR respectively), PFL and PFH groups (100 and 300 mg/kg.bw total flavone of PF respectively), and the positive g

15、roup(FB, 500 mg/kg.bw). The blank group was intragastricly administered distilled water while the other groups were given 50% ethanol. A hour later, the blank group and model group were still given distilled water, and the rest groups were given corresponding dose of PR or PF solution in 6 mL/kg.bw.

16、 And the mice were killed after 11 weeks. The chronic experimental results suggest that PR and PF can inhibit the increasing activity of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase caused by ethanol, exhibiting a hepatoprotective effect on the mice. In the aspect of oxidative stress, PR

17、and PF can not only elevate glutathione level, increasing the antioxidant capacity of liver, but also reduce the endotoxin (LPS) concentration in blood and inhibit mRNA expression of CYP2E1 gene, thus reduce free radicals from macrophage and CYP2E1 to improve the damage of oxidative stress. Furtherm

18、ore, the antioxidant capacity and the HI reduce the lipid level. And PR has a better lipid lowering effect than PF. In the aspect of Inflammatory signal transduction, PR and PF can not only reduce the LPS recognition receptors Toll-like receptor 4 (TLR4) and its downstream adapter protein molecule m

19、yeloid differentiation protein 88 (MyD88) mRNA expression, but also improve the nuclear factor kappaB inhibitor a (iKBa) level, inhibiting the inflammatory signal transduction. And PF has a stronger anti-inflammation effect than that of PR. All the results suggest that Radix Puerariae and Puerariae

20、Flos have a good hepatoprotective effect on the alcoholic liver. PR may inhibit the transcriptional activity of SREBP-lc and reduce the triglyceride synthesis through the activated AMPKa2. While PF can both increase the antioxidant capacity of liver and inhibit the CYP2E1 mRNA expression to reduce t

21、he oxidative damage; Furthermore, PF may be as the ligand of PPARa to raise the mRNA expression of PPARa, which can also indirectly be regulated by the activated AMPKa2, to promote fatty acid oxidation and reduce the triglyceride level. Keywords: Radix Puerariae; Flos Puerariae; Total flavonoids; Ac

22、ute alcoholism; Chronic 4 目 录 W . i Abstract . II M . IV 主要缩略词 . VI 第 1 章绪论 . 1 1.1 酒精性肝病概述 . 1 1.2 酒精代谢 . 1 1.2.1 酒精的代谢途径 . 1 1.2.2 酒精代谢对肝脏的损害及其机理 . 2 1.3 目前国内外解酒护肝产品的研宄状况 . 8 1.4 葛植物的研宄进展 . 9 1.4.1 葛属植物的生物特性 . 9 1.4.2 葛中主要活性成分及其生理功能 . 9 1.4.3 葛解酒护肝机理的研宄进展 . 11 1.5 立题意义与研宄内容 . 12 第 2 章实验材料与方法 . 14

23、2.1 实验材料与仪器 . 14 2.1.1 实验材料及主要试剂 . 14 2.1.2 主要仪器 . 14 2.1.3 实验动物 . 14 2.2 实验方法 . 14 2.2.1 葛根和葛花对急性酒精中毒小鼠的影响 . 14 2.2.2 葛根和葛花提取物 (PR/PF)对慢性酒精肝损伤小鼠的影响及其机理研宄 16 2.3 数据处理 . 19 第 3 章结果与讨论 . 20 3.1 葛根和葛花样品成分分析 . 20 3.2 葛根和葛花对急性酒精中毒小鼠的解酒作用 . 21 3.2.1 葛根和葛花对醒酒时间的影响 . 21 3.2.2 葛根和葛花对血 醇浓度的影响 . 22 3.2.3 小结 .

24、23 3.3 葛根和葛花提取物 (PR/PF)对慢性酒精肝损伤小鼠的影响及作用机理 . 23 3.3.1 PR 和 PF 对小鼠生理病理指标的影响 . 23 3.3.2 PR 和 PF 对小鼠氧化应激的影响 . 26 3.3.3 PR 和 PF 对小鼠脂质代谢的影响 . 28 3.3.4 PR 和 PF 对小鼠炎症信号传导的影响 . 30 5 3.3.5 小结 . 31 轉会吉 it . 33 展望 . 34 M if . 35 #考 t 献 . 36 Pf ffl . 41 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 . 42 VI 主要缩略词 缩写 中文名称 英文名称 PR 葛根提取物 Rad

25、ix Puerariae extract PRW 葛根水提物 Water-extract of Radix Puerariae PRE 葛根醇提物 Ethanol-extract of Radix Puerariae PF 葛花提取物 Puerariae Flos extract PFW 葛花水提物 Water-extract of Puerariae Flos PFE 葛花醇提物 Ethanol-extract of Puerariae Flos ADH 乙醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase ALDH 乙醛脱氢酶 Aldehyde dehydrogenase ALD 酒精性

26、肝病 Alcoholic liver disease HDL 高密度脂蛋白 High density lipoprotein LDL 低密度脂蛋白 Low density lipoprotein LPS 内毒素 / 脂多糖 Lipopolysaccharide SOD 超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase GSH 谷胱甘肽 Glutathione SREBP-lc 固醇调节元件结合蛋白 -lc Sterolregulatoryelementbinding protein lc AMPK012 腺苷酸活化蛋白激酶 ot2 AMP-activated protein kinas

27、e ot2 NF-KB 核转录因子 KB Nuclear factor-KB IKBOI 核因子 KB 抑制剂 a Inhibitor of NF-KB a MDA 丙二酸 Malondialdehyde MyD88 髓样分化蛋白 88 Myeloid differentiation primary response protein 88 MEOS 微粒体氧化酶系 Microsomal ethanol oxidizing system NADH 还原型辅酶 I Nicotinamide adenine dinucleotide-reduced NAD+ 氧化型辅酶 I Nicotinamide

28、-adenine dinucleotide NO 一氧化氮 Nitric oxide GAPDH 甘油酸 -3-磷酸脱氢酶 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase CYP2E1 细胞色素 P450 2E1 Cytochrome P450 2E1 PPARa 过氧化物酶体增殖物激活受 Peroxisome proliferators-activated receptors a 体 a TRL4 Toll 样受体 4 Toll-like receptors 4 TC 总胆固醇 Total cholesterol TG 甘油三酯 Triglycerol TN

29、F-a 肿瘤坏死因子 a Tumor necrosis factor a NOX NADPH 氧化酶 NADPH oxidase 第 1 章 绪 论 中国是一个历史悠久的酒文化国家，酒作为日常生活中一种常用的饮品，适量饮 用可以疏通经脉，行气和血，散湿止痛，温阳祛寒，具有养生保健的功效。如果短期 内大量摄取酒精则易导致急性酒精中毒，产生头晕、恶心、呕吐等不适症状。长期过 度饮酒则会引起慢性酒精中毒，导致酒精性肝病，使人体产生心肌乏力、黏膜损伤、 血管变脆、肾功能衰竭等病理变化，还会引起机体生理功能紊乱，危害人体健康。 1.1 酒精性肝病概述 酒精性肝病 (Alcoholic liver dis

30、ease， ALD)是因为长期、大量饮用各种含酒精的饮 料所导致的肝脏损害性病变，是全世界备受关注的公共卫生问题。根据中华医学会在 2010 年修订的酒精性肝病诊疗指南，在组织病理学上 ALD 主要表现为三种形式： 酒精性脂肪肝 (Alcoholic fatty liver， AFL) 酒精性肝炎 (Alcoholic Hepatitis， ALH) 酒精性肝纤维化 (Alcoholic liver fibrosis， ALF)和肝硬化 (Alcoholic liver cirrhosis， ALC)，这三种形式可单独或混和存在 1。轻度 AFL 患者多无症状，而中、重度酒精性 脂肪肝可呈现类

31、似慢性肝炎的表现，常见的症状为： 由于脂肪浸润而引起肝脏肿大 及压痛。 由于肝细胞坏死而出现黄疸、恶心、呕吐等症状。 门脉高压及合并症， 表现脾脏肿大、食管静脉曲张及腹水等。 其它如蜘蛛痣、肝掌等症状。若酒精性脂 肪肝患者不积极进行预防和治疗，将直接导致病情进一步恶化发展成为酒精性肝炎和 肝纤维化，乃至肝硬化。 在 重 度 饮 酒 者 中 ， 80% 以 上 有 不 同 程 度 的 酒 精 性 脂 肪 肝 ， 其 中 10% 35% 可 发 展 为 酒 精 性 肝 炎 ， 10% 20% 可 发 成 肝 纤 维 化 及 肝 硬 化 。 据 不 完 全 统 计 ， ALD 的 发 病 率 呈 逐

32、 年 梯 次 上 升 ， 其 病 变 程 度 与 饮 酒 总 量 成 正 比 。 在 2000 2004 年 度 中 ， 酒 精 性 肝 病 占 同 年 其 它 肝 病 比 例 分 别 为 2.4% 、 2.7% 、 2.8% 、 3.4 % 和 4.3% 。 目 前 ， 中 国 酒 精 性 肝 病 患者肝脏损伤严重，其中酒精性肝炎患者占 28.8%,酒精性肝硬化患者占 37.4%。 1.2 酒精代谢 乙 醇 主 要 在 胃 肠 道 部 位 以 被 动 扩 散 的 方 式 吸 收， 5 min 后 便 可 从 血 液 中 检 测 出 ， 一 般 在 饮 酒 后 30 min 90 min 血 醇 浓 度 可 达 到 高 峰 。 其 中 2% 10%乙 醇 由 肾 和 肺 排 出 ， 15%由 肝 外 器 官 代 谢 ， 而 绝 大 部 分 乙 醇 则 在 肝 脏 内 进 行 分